[发明专利]一种高毒力蝗绿僵菌工程菌株及其构建方法

权利要求书

1.一种高毒力蝗绿僵菌工程菌，其特征在于：所述蝗绿僵菌工程菌为蝗绿僵菌敲除了腺苷酸形成还原酶Adenylate-Forming Reductases（AFR）基因的工程菌株；所述蝗绿僵菌采用保藏编号为CGMCCNo. 0877的CQMa102菌株，所敲除的AFR基因为所述蝗绿僵菌CQMa102菌株的基因，cDNA的序列为SEQ ID NO.9所示。

2.如权利要求1所述的蝗绿僵菌工程菌，其特征在于：在所述蝗绿僵菌工程菌中，所敲除的AFR基因被由AFR基因的上游同源臂，标记基因以及AFR基因的下游同源臂组成的重组基因代替。

3.如权利要求1或2所述的蝗绿僵菌工程菌在制备杀虫剂中的应用。

4.一种杀虫菌剂，其特征在于：所述杀虫菌剂的活性成分是高毒力的蝗绿僵菌工程菌，所述蝗绿僵菌工程菌为蝗绿僵菌敲除了腺苷酸形成还原酶Adenylate-FormingReductases（AFR）基因的工程菌株；所述蝗绿僵菌采用保藏编号为CGMCCNo. 0877的CQMa102菌株，所敲除的AFR基因为所述蝗绿僵菌CQMa102菌株的基因，cDNA的序列为SEQ IDNO.9所示。

5.如权利要求4所述的杀虫菌剂，其特征在于：在所述蝗绿僵菌工程菌中，所敲除的AFR基因被由AFR基因的上游同源臂，标记基因以及AFR基因的下游同源臂组成的重组基因代替。

6.如权利要求1或2所述高毒力蝗绿僵菌工程菌的构建方法，其特征在于，包括如下步骤进行：

1）PK2-PB-MaAFR-L/R重组质粒的构建

根据蝗绿僵菌基因组序列设计PCR引物，扩增出腺苷酸形成还原酶蛋白编码基因的上、下游重组臂，并纯化扩增产物，上游同源重组臂为SEQ ID NO.10所示，下游同源重组臂为SEQ ID NO.11所示，酶切载体质粒PK2-PB并纯化线性质粒，上游重组臂片段与线性质粒在重组酶中进行一步克隆，重组产物至大肠杆菌感受态DH5α，得到PK2-PB-MaAFR-L/R重组质粒；

2）回复载体pK2-sur-MaAFR-egfp的构建

从蝗绿僵菌基因组中扩增带有MaAFR自身启动子与编码区的序列，MaAFR的cDNA

的序列为SEQ ID NO.9所示，与pK2-sur::egfp载体使用一步克隆的方法进行连接；

3）农杆菌的转化以及与蝗绿僵菌的共培养

将PK2-PB-MaAFR-L/R的质粒转化农杆菌后与蝗绿僵菌的共培养发生同源重组，回复转化使用ΔMaAFR蝗绿僵菌孢子；

4）蝗绿僵菌转化子的筛选。