[发明专利]一种采用离体角膜器官评价光损伤的体外方法

说明书

本发明公开了一种采用离体角膜器官评价光损伤的体外方法，其特征是包括以下步骤：(1)离体角膜的制备和维持：无菌环境下分离动物离体眼球完整角膜，并固定于专用的生物膜夹持器中，生物膜夹持器填充相应的培养液，置于培养箱中孵育；(2)光损伤模型的制备：卸下生物膜夹持器前室玻璃片，暴露角膜上皮；(3)药物干预：选择受试物干预的模式和时间；(4)评价指标的测量：测量角膜厚度、角膜浑浊度、角膜上皮渗透性、氧化应激或炎症相关指标，还包括对角膜进行组织学分析；(5)结果分析：对所选指标进行处理，并做数据分析。本方法具有成本低、通量高、可重复、不额外牺牲动物等优点，可以对多种受试物进行快速评价。

技术领域

本发明涉及一种采用离体角膜器官评价光损伤的体外方法。

背景技术

日常生活中，人类的眼睛暴露于紫外光后可诱发光对角膜的损伤作用，尤其是长时间暴露在阳光下(接触高剂量紫外线)会造成眼睛损伤，损伤包括白内障、黄斑变性、结膜黄斑、翼状胬肉和角膜炎。

UVA更接近可见光，能量比UVB和UVC低。但是UVA射线可以通过角膜到达眼睛内的晶状体和视网膜。过度暴露于UVA辐射与某些类型的白内障的发展有关，UVA射线可能在黄斑变性的发展中起作用。角膜几乎吸收了90％以上的UVB，在高短期剂量下，UVB射线也会引起光角膜炎，或称光角膜晒伤，是一种角膜疼痛的炎症反应。

在高海拔地区，长时间在海滩或滑雪时，可能导致严重的光角膜炎，称为“雪盲症”，通常持续24-48小时可以导致暂时性视力丧失，并伴有疼痛。而工人(如电焊工)职业暴露于工业高强度UV，容易造成角膜炎或结膜炎等损伤。

光毒性物质由于吸收光子，被激活后释放能量或者刺激机体产生自由基，从而引起机体局部损伤效应。角膜直接暴露于光线下，环境中的水溶性或脂溶性外源化学物接触于眼睛后，可能诱发眼光毒性效应，对角膜和眼球产生有害相应。

目前眼科研究通常采用动物模型(兔子)进行，且缺乏公认一致的毒理学评价方法。传统动物实验的缺点包括：主观性/重复性差、物种差异、周期长、成本高、通量低、使用活体动物造成动物痛苦死亡等。

目前，以体外技术为核心的试验方法，逐渐被许多国家和地区的监管部门所接收和认可。美国替代方法研究评价中心(ICCVAM)提出了一系列非动物测试方法。全球范围内多个地区和国家通过法规禁止/部分禁止或限制动物试验的进行。目前开发了多种眼刺激体外方法，用于取代原有的兔子眼刺激/腐蚀性测试，但是尚无眼光毒性/光损伤的体外评价方法。

体外方法是根据体内眼光损伤发生的机理开发的，角膜直接暴露于UV，可直接导致角膜基质粘多糖裂开，并且改变其生理功能。离体角膜来源于废弃的动物眼球组织，不需要额外牺牲动物，天然角膜与人体角膜接近，离体角膜在短期内可以维持正常生理活性，可以模拟角膜光暴露，且成本低、结果稳定。牛角膜浑浊度渗透性试验是OECD认可的替代方法之一，用于取代传统兔眼试验，用于眼损伤的分类和标示，其应用广泛，数据被多方所接受。

实际生活中，眼球可能接触到多种外源化学物和紫外线，角膜作为眼球最外层直接接触紫外线，紫外线可直接或间接(激活光毒物)造成光损伤，而评估光损伤的保护和修复作用的模型目前尚未成型，也缺乏评价眼光毒物的方法。目前基于离体角膜眼光损伤模型未见相关专利和文献报道。

发明内容

本发明所要解决的技术问题，就是提供一种采用离体角膜器官评价光损伤的体外方法，利用离体动物角膜的光损伤模型，评价受试物质对光损伤角膜的保护和修复作用，或者用于眼光毒性的评价，本方法具有成本低、通量高、可重复、不额外牺牲动物等优点，可以对多种受试物进行快速评价。

解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案来实现的：

一种采用离体角膜器官评价光损伤的体外方法，其特征是包括以下步骤：

(1)离体角膜的制备和维持