[发明专利]一种利用鱿鱼内脏筛选菌种的方法及该菌种的应用

权利要求书

1.一种利用鱿鱼内脏筛选菌种的方法，其特征在于包括以下步骤：

（1）无菌环境下，将鱿鱼内脏灭菌后均浆为半固体；

（2）无菌环境下，将半固体的鱿鱼内脏、无菌水和混合菌液一起发酵培养，得鱿鱼内脏发酵液；

（3）无菌条件下，将鱿鱼内脏发酵液用无菌水进行梯度稀释，将稀释后的鱿鱼内脏发酵液涂布在无菌培养基中培养至有明显的菌落生长；

（4）无菌条件下，挑取数量最多的三种不同形态的菌落，依次命名为X1、X2、X3，每种形态的单菌落分别划线在不同的无菌培养基中培养至有明显的菌落生长；

（5）无菌条件下，将经步骤（4）培养的分别划线有X1、X2、X3的培养基中X1、X2、X3的单菌落再次划线到无菌培养基中培养；重复划线至少3次，最后得到的菌种即为分离纯化后的菌种X1、X2、X3。

2.如权利要求1所述的一种利用鱿鱼内脏筛选菌种的方法，其特征在于：步骤（2）中，所述鱿鱼内脏、无菌水的料水比为1:1~9，混合菌液的添加量为鱿鱼内脏悬液体积的3~25%。

3.如权利要求2所述的一种利用鱿鱼内脏筛选菌种的方法，其特征在于：所述混合菌液的添加量为鱿鱼内脏悬液体积的3~8%。

4.如权利要求3所述的一种利用鱿鱼内脏筛选菌种的方法，其特征在于：所述混合菌液中的菌群包括光合菌群、酵母菌群、革兰氏阳性放线菌群和发酵系的丝状菌群，混合菌液的质量百分浓度为0.4~1%。

5.如权利要求1所述的一种利用鱿鱼内脏筛选菌种的方法，其特征在于：步骤（2）中，所述发酵培养的温度为28~30℃，摇床转速为100~120r/min，培养时间为1~2d。

6.如权利要求1所述的一种利用鱿鱼内脏筛选菌种的方法，其特征在于：步骤（3）中，所述稀释后的鱿鱼内脏发酵液为三个梯度，分别为梯度稀释前浓度的10^-4、10^-5、10^-6倍的鱿鱼内脏发酵液，所述培养的条件与步骤（2）中培养的条件相同。

7.如权利要求1所述的一种利用鱿鱼内脏筛选菌种的方法，其特征在于：步骤（3）、（4）、（5）中，所述的无菌培养基为购于青岛海博生物技术有限公司的营养琼脂培养基经121℃灭菌30min得到的。

8.如权利要求1所述的一种利用鱿鱼内脏筛选菌种的方法，其特征在于：对步骤（5）中所述的分离纯化后的菌株X1、X2、X3进行鉴定，鉴定方法为：将分离纯化后的菌株X1、X2、X3分别划线到营养肉汤固体培养基平板上，将营养肉汤固体培养基平板上长出来的菌落进行革兰氏染色后在显微镜下观察菌落形态；同时，经过细菌基因组提取、特异引物扩增16SrDNA序列、纯化PCR产物、DNA测序获得X1、X2、X3的16SrDNA序列，得到的X1、X2、X3的16SrDNA序列分别如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3所示。

9.一种利用如权利要求1所述方法筛得的菌种在降解鱿鱼内脏中的应用，其特征在于包括以下步骤：

（a）菌种活化：分别将单菌株X1，X2，X3的菌液接种到不同的无菌营养肉汤琼脂培养基中，在28~30℃，100~120r/min条件下恒温震荡培养23~25h，得单菌株的活化菌液；

（b）将活化扩大的菌株X1，X2，X3分别对鱿鱼内脏进行发酵实验，鱿鱼内脏与活化菌液的料液比为1:1~9，发酵pH为5~9，发酵温度为20~40℃，发酵时间为1~5d，用Folin-酚法测发酵液中可溶性蛋白含量，最后计算蛋白转化率。

10.如权利要求9所述的方法，其特征在于：步骤（a）中，所述单菌株X1，X2，X3的菌液与无菌营养肉汤琼脂培养基的体积比为1:50~100；单菌株X1，X2，X3的菌液为单菌株X1，X2，X3分别在不同的无菌营养肉汤琼脂培养基中，在28~30℃，100~120r/min条件下恒温震荡培养4~18h得到的菌液。