[发明专利]甜菊糖苷的鉴定方法

说明书

本技术发明利用甜菊糖苷本身的结构特点，简化分析手段，直接利用质谱和二级质谱(MS/MS)技术，在少于2分钟时间内，根据一个固定范围的离子出现情况，对照本技术提供的参考表，快速鉴定目前已知天然甜菊糖苷组分。

技术领域

本发明涉及对甜菊糖苷的鉴定技术。

背景技术

甜菊糖作为新一代低能量甜味剂，来源于南美甜料作物甜叶菊，生物安全性优于人工合成甜味剂，南美当地已有超过百年使用甜菊糖的历史。甜菊糖的甜度是甜度标准品蔗糖的200倍以上，而且不能消化成单糖，所以在人体不产生热量。2006年世界卫生组织(WHO)和联合国粮农组织(FAO)联合食品添加剂专用委员会(JECFA)通过了甜菊糖健康无害的安全评价。2008年美国FDA正式批准允许甜菊糖在食品中使用。2011年甜菊糖取得了欧洲的食品安全局安全性检验证书。甜菊糖是天然来源、食用安全，甚至对糖尿病人都可使用，而且还具有积极的健康治疗功效，具有降血压、降血糖、抑菌和抗腹泻等生物活性。

甜菊糖是多种甜菊糖苷的总称。所有甜菊糖苷都具有共同的结构形式，都以甜叶醇(Steviol)为核心骨架，并在甜叶醇的C13-羟基(简称为R1位)和C19-羧基(简称为R2位)位置分别连上葡萄糖苷。根据分别在甜叶醇的C13-羟基和C19-羧基所连葡萄糖苷的个数对不同甜菊糖苷进行命名。不同的甜菊糖苷体现出不同的甜度水平和口感好坏。

鉴于不同的甜菊糖苷具有不同的甜度和口味感受，因此甜菊糖生产企业、进出口商品检验机构或者行业标准的制定都需要一种准确、快速鉴定不同的甜菊糖苷混合物或评价甜菊糖苷纯品质量的方法。目前甜菊糖行业中普遍采用单纯的高效液相色谱(HPLC)技术，或借助HPLC技术对样品初步分离，然后再利用其它包括质谱、二级质谱技术手段进行。两种现有技术都依赖于HPLC技术，最大的缺点就是耗时长(至少30分钟)。单纯采用HPLC的方法受干扰因素多、分析结果不确切，加之某些甜菊糖苷在C18色谱柱上无法分开或保留时间非常接近，同时HPLC的方法依赖于标准品作为参照，针对全新的甜菊糖苷样品，如果没有标准品，则无法使用。因此HPLC的方法无法满足现阶段新型甜菊糖苷产品快速分析、鉴定、评价的要求。同样道理先借助HPLC进行样品初步分离，再进行质谱、二级质谱方法，由于依赖HPLC，虽然可以改善分析结果不确切的问题，但是耗时长的主要缺点仍然无法避免。同时由于不同甜菊糖苷的葡萄糖基位置不一样，但是葡萄糖基的总个数有重合，导致分子式和分子量一样，比如RA和RE的分子式都是C₄₄H₇₀O₂₃，但名称、口味、甜度迥异，仍然无法准确鉴定。况且质谱，特别是二级质谱的解谱复杂，不易掌握。

发明内容

本发明的目的是提供一种对甜菊糖的快速鉴定、质量评价的方法，解决了现有技术中存在的耗时长，结果不准确的问题。

具体地，本发明提供了甜菊糖苷的鉴定方法，它包括如下内容：

(1)将待测甜菊糖苷经过一级和二级质谱分析；

(2)一级质谱分析中，至少获得待测甜菊糖苷的分子量和阴离子[M-H]-的质荷比；

(3)一级质谱分析中，通过如下公式计算待测甜菊糖苷中葡萄糖基的个数：([M-H]-－甜叶醇离子质荷比)/葡萄糖基质荷比；在允许的误差范围内，该部分计算后若不为整数，可四舍五入。

(4)二级质谱中，分析质荷比位于甜叶醇离子到[M-H]-之间的二级离子片断；

(5)二级质谱分析中，对C19-位的葡萄糖基数量进行分析；该数量的计算有两种情况：(a)在给定条件下的二级质谱中若不存在明显的最高丰度的离子片断峰，则该数量为0；(b)在给定条件下的二级质谱中存在明显的最高丰度的离子片断峰，则该数量为A类离子数量加1；其中，A类离子的质荷比在丰度最高的特征离子与[M-H]-之间，且其质荷比＝丰度最高的特征离子质荷比+(葡萄糖基质荷比×n)，n为正整数；