[发明专利]重组Protein A蛋白及其高效表达和应用

权利要求书

1.一种重组Protein A，其特征在于：所述重组Protein A的氨基酸序列为SEQ IDNO.1。

2.根据权利要求1所述的一种重组Protein A，其特征在于：所述重组Protein A的核酸序列为SEQ ID NO.2。

3.一种权利要求1、2所述的重组Protein A作为免疫球蛋白结合蛋白在Protein A蛋白亲和层析技术中的应用。

4.一种高产无内毒素抗体纯化Protein A亲和填料，其特征在于：所述亲和填料由重组Protein A和琼脂糖凝胶相偶联而成。

5.根据权利要求4所述的一种高产无内毒素抗体纯化Protein A亲和填料，其特征在于：所述重组Protein A的氨基酸序列为SEQ ID NO.1。

6.根据权利要求4所述的一种高产无内毒素抗体纯化Protein A亲和填料，其特征在于：所述重组Protein A的核酸序列为SEQ ID NO.2。

7.一种权利要求4-6所述高产无内毒素Protein A亲和填料在抗体纯化的亲和层析技术中的应用。

8.一种权利要求4-6所述高产无内毒素抗体纯化用Protein A亲和填料的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：

a．称取琼脂糖微球，加入去离子水悬浮溶胀，用纯化水冲洗，抽干备用；

b．将Protein A置换到PBS溶液中，并加入碳酸钠，备用；

c．将Protein A溶液和上述处理后的琼脂糖微球混合，震荡过夜；

d．静置后离心，用含氯化钠的柠檬酸缓冲液和含氯化钠的PBS，交替洗涤，重复3次，再用大量的纯化水冲洗。

9.一种权利要求1-3所述重组Protein A的高效表达方法，其特征在于：包括以下步骤：

a. Protein A 基因克隆及载体质粒的构建

采用DNA全序列合成法来人工合成Protein A核苷酸序列和对应的氨基酸序列，氨基酸序列为SEQ ID NO.1，核酸序列为SEQ ID NO.2；将Protein A核苷酸序列加入酶切位点与pPICZα酵母表达载体连接，连接产物转化DH5α感受态细胞，测序验证；

b. 毕赤酵母表达工程菌的转化和制备

将步骤a中构建的pPICZα-Protein A经限制性内切酶处理后电转化到毕氏酵母菌菌株X33感受态细胞内培养，经抗性选择而获得阳性转化子；

c. 重组酵母工程菌的筛选

将数个含有待表达基因的酵母菌落分别在含有Zeocin抗生素，具有缓冲能力及甘油的基本培养液中培养；培养一段时候后离心收集菌体，菌体再重悬于不含甘油的同种基本培养液内，含0.5%甲醇；每24小时加入100%甲醇至最终浓度为0.5%，在不同的时间点分别收集培养上清液，筛选表达特异蛋白的重组酵母工程菌株；

d. 大规模高密度表达和生产制备重组Protein A蛋白

使用500L和1000L生物发酵罐系统，取一支工程菌种子库，小规模摇床培养开始，然后扩增到一级种子罐、二级种子罐，进入生产发酵罐；经培养至罐内甘油消耗尽，溶氧随之回至底限再回升时，启动甘油流加；待流加结束，溶氧再回升时，启动甲醇流加，进入诱导和重组蛋白生产阶段，维持72小时甲醇流加。