[发明专利]一种微孔反应板制备方法、试剂盒以及试剂盒的检测方法

权利要求书

1.一种微孔反应板制备方法，其特征在于，所述的微孔反应板内部设置有示踪物微球，微孔反应板由以下步骤制成：

步骤1）、将多孔微板空白板的微孔反应板制备成包被板；

步骤2）、制备示踪物微球，将1mg~3mg目标抗原（抗体）加入1mg的Eu3+-N2-[P-异氰酸-苄基]-二乙烯三胺四乙酸钠中混匀，25℃反应24h；

步骤3）、反应液经Sephadex G－50柱（1×40cm）用50mmol/L、pH7.8的Tris-HCl缓冲液洗脱，分离示踪结合物与游离Eu3+；

步骤4）、采用全自动部分收集器1ml/管进行液体收集；

步骤5）、于时间分辨荧光免疫分析仪上进行荧光计数，收集第一峰中荧光计数大于10000000的洗脱液,混匀后2~8℃保存；

步骤6）、采用棋盘滴定法确定铕标记工作液浓度，然后用稀释液再按一定的比例稀释后进行冻干成微球，将冻干后的微球转移至步骤1）中包被板中，密封，再转移至铝塑袋中，于2~8℃中保存。

2.根据权利要求1所述的一种微孔反应板制备方法，其特征在于，所述步骤1）中的包被板由以下步骤制成：

步骤1）采用含有1～10ppm防腐剂的缓冲液将目标抗原或抗体稀释成1～10μg/ml的包被液；

步骤2），在多孔微板空白板中加入包被液100～200μl/孔，并且在35℃条件下孵育过夜；

步骤3），孵育好的包被板用工作洗涤液洗板1次，拍干；

步骤4），将洗涤过的包被板按250～280μl/孔加入封闭液，25±2℃条件下孵育过夜；甩干，过夜晾干；

步骤5），将权利要求1中制备示踪物微球加入包被板中；

步骤6），用自封袋密封；置2～8℃条件下保存。

3.根据权利要求2所述的一种微孔反应板制备方法，其特征在于，所述的缓冲液为含5ppm Proclin300®的0.05mol/L、pH9.6的碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液。

4.根据权利要求2所述的一种微孔反应板制备方法，其特征在于，所述的封闭液为含5.0g/L海藻糖、0.5%BSA，0.05mol/L、pH9.6的碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液。

5.根据权利要求2所述的一种微孔反应板制备方法，其特征在于，所述的工作洗涤液为浓缩洗液和去离子水按1：20混合而成：所述的浓缩洗液为在含0.385mol/L NaCl,0.124mol/L、pH7.8的Tris-HCl缓冲液中加入1.0ml/L～10.0ml/L的Tween-20而成。

6.一种试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包括复溶试剂、浓缩洗液、增强液、标准品、质控品以及权利要求1-5中任意一项所述的微孔反应板。

7.根据权利要求6所述的一种试剂盒，其特征在于，所述的复溶试剂为在含0.01g/L的乙二胺四乙酸二钠的50mmol/L、pH7.8的Tris-HCl溶液中加入1.0g/L～20.0g/L的牛血清白蛋白。

8.根据权利要求6所述的一种试剂盒，其特征在于，所述的浓缩洗液为在含0.385mol/LNaCl,0.124mol/L、pH7.8的Tris-HCl缓冲液中加入1.0ml/L～10.0ml/L的Tween-20。

9.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述的增强液为在含有1ml/L TritonX-100、0.1mol/L邻苯二甲酸氢钾-冰醋酸溶液中加入1～5mg/Lβ-萘甲酰三氟丙酮、15～30mg/L的三正辛基氧化磷。

10.试剂盒的检测方法，其特征在于，包括由下步骤：步骤1）将试剂所需数量的微孔反应板条平衡至室温；

步骤2）将上述浓缩洗液和去离子水按1：20混合成工作洗涤液；

步骤3）将标准品、质控品用纯化水按标示体积复溶；

步骤4）向每孔中分别加入100～200μl复溶试剂；

步骤5）然后依次加入25～100μl标准品、质控品或待测标本；反应体系在37℃下，振荡孵育10～30分钟；

步骤6）采用上述的工作洗涤液洗板4-6次，拍干；

步骤7）向每孔中加入50～200μl增强液,缓慢振荡5min，于荧光读数仪内进行荧光计数；

步骤8）按测定参数进行拟合分析，得到定量结果。