[发明专利]一种三七类甜蛋白基因PnTLP5及应用

说明书

本发明公开了一种三七的病程相关蛋白5家族类甜蛋白基因PnTLP5，其核苷酸序列如SEQ IDNO:1所述，编码如SEQ IDNO：2所示氨基酸序列的三七类甜蛋白；本发明通过分子生物学和基因工程相关技术研究证实PnTLP5基因具有提高植物抗真菌的功能，将本发明抗真菌PnTLP5基因构建到植物表达载体上并转入烟草中过量表达，结果转基因烟草植株具有很强的体外抗真菌活性，超表达PnTLP5的转基因烟草对核盘菌、茄腐镰刀菌、轮枝镰刀菌、人参链格孢、葡萄座腔菌等五种真菌的生长具有显著的抑制作用。

技术领域

本发明涉及分子生物学以及基因工程相关技术研究领域，特别是一种具有抗真菌活性的三七类甜蛋白基因PnTLP5及应用。

背景技术

三七（Panax notoginseng）是中国历史悠久的中草药。三七主产于云南文山州砚山县、马关、西畴、广南、麻栗坡、富宁、邱北等，另广西田阳、靖西、田东、德保等地也有种植。云南文山州的三七历史悠久、产量大、质量好，习称“文三七”、“田七”，为著名的道地药材。三七常年生长在阴蔽环境中，病虫害发生较为严重，据统计，三七上发生的病虫害大约有20多种。其中，主要的有根腐病、黑斑病、圆斑病、疫病、白粉病、蛞蝓、地老虎、蚜虫、介壳虫、尺蠖等，三七每年都因病虫的危害造成极为严重的损失。因此，加强三七病虫害防治是保证三七产量、质量的一项主要措施。

三七栽培中的病害问题比较突出，其中三七黑斑病就是七园中一个主要病害。三七的茎、叶、花均可受害，被害部初期呈椭圆形浅褐色病斑，继成黑褐色，病斑向上下扩展、凹陷，最后出现茎干或花盘扭折死亡。受害三七轻者产量、质量下降，重者减产90%以上。目前对三七真菌病害的控制有如下几种方式：使用化学杀菌剂；采取轮作、避免带菌土壤和带病原植物材料的传播等。但是无论是化学杀菌还是轮作都不能从根本上解决三七病害的问题。但是随着分子生物学理论和技术的不断发展，使人们不但能够从分子水平上深入认识植物与病原物相互作用的机制，而且还可以通过基因工程快速和高效地培育抗病作物新品种，是提高植物抗病能力的新方法。

病程相关蛋白(Pathogenesis-related proteins，PRs)最早从烟草(Nicotiana tabacum )花叶病毒(Tobacco mosaic virus， TMV)侵染的烟草叶片中发现，依据氨基酸组成、生物化学和血清学特性，将PRs分为17个不同的蛋白家族，即PR-1~PR-17。由于PR-5家族中一些蛋白质的氨基酸序列与西非竹竽(Thaumatococcus daniellii )甜蛋白（Thaumatin）的氨基酸序列高度同源，因此又被称为类甜蛋白(Thaumatin-like proteins，TLPs)（李文娴, 刘迪秋, 等.类甜蛋白的结构特征以及功能研究进展.中国生物工程杂志,2010 , 30 (3) :100-104.）。TLPs在高等植物内广泛分布，包括花粉管壁、精细胞壁、筛管端壁等，它们在植物正常生长发育中发挥重要作用。更重要的是，TLPs在植物的抗病过程中也扮演着重要角色。TLPs与植物的抗逆反应有关，当植物受到病原物、化学因子、物理因子等胁迫时，TLPs基因在植物体特定部位迅速表达并积累(姜晓玲, 黄秋娴, 等. 植物类甜蛋白基因家族研究进展. 浙江农林大学学报, 2012, 29(2):279-287.)。许多研究发现植物TLPs具有显著的抗真菌活性，一些转TLPs基因的植株对于真菌病害的抗性也显著增强，因而近年来，TLPs的抗真菌功能在植物病理学研究中受到越来越广泛的关注。