[发明专利]一种适用于单链DNA的高通量测序文库构建方法

说明书

本发明公开了一种适用于单链DNA的高通量测序文库构建方法。本发明方法包括：将单链模板与带有简并碱基的双链接头1相连(带有简并碱基的特殊接头使单链模板与双链接头连接成为可能，双链接头可随机地结合到单链模板上，使接头序列与模板充分靠近，再使用T4 DNA连接酶完成连接)；采用延伸引物进行延伸，得到双链产物；将双链产物与接头2相连；以所得连接产物为模板，进行PCR扩增，获得所需文库。本发明可用于构建高通量测序文库，且可用于单链DNA文库构建，本发明将提高高通量测序文库构建中单链DNA利用率，进一步实现低起始量建库的目的，在未来肿瘤早筛和预后监测应用中发挥关键作用。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种适用于单链DNA的高通量测序文库构建方法。

背景技术

自2005年第一台高通量测序仪诞生以来，高通量测序方法发展迅速，推陈出新，在测序公司和科研人员的不断努力下，完成了技术的更新迭代(VAN DIJK E L,AUGER H,JASZCZYSZYN Y,et al.Ten years of next-generation sequencing technology[J].Trends Genet,2014,30(9):418-26.)。测序技术的发展推动着高通量测序的不断进步，建库技术的发明与改进也在高通量测序发展中起到了举足轻重的作用。

在高通量测序技术发展史上，研究人员根据不同的建库原理开发了许多建库技术，如基本的双链建库、随机引物建库、AmpliSeq建库、转座酶建库、免疫共沉淀建库等方法(HEAD S R,KOMORI H K,LAMERE S A,et al.Library construction for next-generation sequencing:overviews and challenges[J].Biotechniques,2014,56(2):61-4,6,8,passim.)。双链建库是一种最为基础的建库方法，将DNA进行片段化或将RNA进行反转录成cDNA后，在模板两端加上与测序平台匹配的接头序列，即完成文库构建，由于此方法数据稳定性较好及适用的环境广，双链建库的研究和应用也更为普遍。

现有的双链建库方法无法将单链DNA转化为测序文库：(1)研究表明，cfDNA中也存在有单链DNA，而此类建库方法使用T4DNA连接酶在双链DNA末端连接上双链接头，无法将单链DNA转化为可供测序的文库。(2)目前甲基化测序的方法(亚硫酸氢钠测序法)需要使用重亚硫酸盐处理，但重亚硫酸盐处理会导致DNA分子断裂、形成单链。而目前的甲基化文库构建方法大多是在完成接头连接后进行重亚硫酸盐处理，最终导致分子转化率低的问题。双链建库无法使用UNG去除DNA损伤：一些质量较差的DNA类型，如FFPE样本、古DNA等均存在一定的损伤，有研究表明这些类型的损伤主要是胞嘧啶脱氨基形成尿嘧啶，经过PCR会导致C>T碱基转换，从而导致错误的测序结果(DO H,DOBROVIC A.Dramatic reduction ofsequence artefacts from DNA isolated from formalin-fixed cancer biopsies bytreatment with uracil-DNA glycosylase[J].Oncotarget,2012,3(5):546-58.)。目前去除DNA中尿嘧啶的方法是使用尿嘧啶-N-糖基化酶(uracil N-glycosylase，UNG)处理DNA，该酶可以选择性水解断裂含有dU的双链或单链DNA中的尿嘧啶糖苷键(HOFREITER M.DNAsequences from multiple amplifications reveal artifacts induced by cytosinedeamination in ancient DNA[J].Nucleic Acids Research,2001,29(23):4793-9.)。但经过UNG酶处理后的DNA，因碱基缺失会导致DNA分子断裂形成单链，采用双链建库的方法无法利用这些DNA，结果在去除尿嘧啶的同时导致了DNA分子的损失。