[发明专利]一种高生物活性细胞膜仿生微囊泡及其制备方法与应用

说明书

本发明提供一种高生物活性细胞膜仿生微囊泡及其制备方法与应用，该方法具体是一种将贴壁细胞与纳米材料孵育后，置于生物相容性缓冲液中并于白光光源光照下，制备高生物活性细胞膜仿生微囊泡的方法。该方法与化学试剂诱导法(多聚甲醛和二硫苏糖醇)相比，其产率显著提高，是化学试剂诱导法的的3～6倍；且该方法普适性好，能适用于所有贴壁细胞，包括肿瘤细胞和非肿瘤细胞。该方法制备出来的细胞膜仿生微囊泡保持较好的生物活性和生物相容性，其具有类似细胞膜的结构和性质，是研究精准药物递送、细胞仿生以及细胞膜结构和性质的理想模型。

技术领域

本发明涉及一种细胞膜仿生微囊泡的制备方法与应用，尤其涉及一种具有高生物活性的细胞膜仿生微囊泡及其制备方法与应用。

背景技术

仿生微囊泡主要是由磷脂和蛋白组成的、类似细胞膜的封闭双分子层结构。仿生微囊泡具有类似细胞膜的结构、类似细胞大小的尺寸，以及可提供相对稳定的内环境的特点，因此被广泛用于细胞仿生研究。目前，仿生微囊泡被用于模拟生命活动过程，模拟细胞的结构和功能以及构筑智能仿生系统，引起化学和生物交叉领域的广泛关注。研究显示，具有类似细胞膜结构的仿生微囊泡是用于细胞仿生研究的理想模型，目前，细胞膜仿生微囊泡主要作为细胞膜模型用来研究细胞膜的相结构和相分离、细胞膜脂筏区的性质、以及生物分子相互作用等。

化学合成法(水合法、乙醇注射法、双重乳剂法等)是制备微囊泡的常用方法。虽然化学合成的微囊泡结构简单，成分可调控，但是这种微囊泡缺乏生物活性组分，难以模拟天然细胞膜复杂的结构和性质。相对而言，从细胞中提取的细胞膜仿生微囊泡由于具有类似细胞膜的结构和组分，有利于细胞仿生研究。

目前，从细胞中提取细胞膜仿生微囊泡的方法主要使用化学试剂诱导法或者高盐试剂诱导法，例如：Erdinc Sezgin等人采用含有多聚甲醛、二硫苏糖醇的缓冲液与细胞孵育，从而获取细胞膜微囊泡，但二硫苏糖醇是一种还原剂，可以破坏蛋白质中半胱氨酸间的二硫键，多聚甲醛能使蛋白交联，因此影响细胞膜微囊泡的生物活性；Cohen等人采用低渗溶液处理细胞，通过将细胞与缓冲液孵育使细胞产生细胞膜微囊泡，但这种方法仅对基底具有高粘附能力的细胞(如，表皮样癌细胞系A431)有效；Nuala Del Piccolo等人利用含有氯盐的缓冲溶液(200mM NaCl，5mM KCl，0.5mM MgCl₂，0.75mM CaCl₂溶解在pH＝8.5的N，N-二羟乙基甘氨酸中)从中国仓鼠卵巢细胞(CHO)中提取细胞膜微囊泡，然而进行后续研究时，这种制备方法存在需要分离细胞膜微囊泡的问题。总之，现有的制备细胞膜微囊泡的方法存在以下问题：(1)化学试剂或者高盐缓冲液不利于保持细胞膜上生物分子的活性，不利于长时间保存；(2)由于使用生物不相容缓冲液，需要繁琐的分离提纯操作，费时费力、产率低，不利于后续研究。

对比文件1：CN106289927A公开一种从肿瘤细胞上清中分离微囊泡及其外泌体的方法，所述方法为：将肿瘤细胞贴壁培养后，取培养液离心，取上清液与偶联复合物混合，在4℃、100～300rpm水平振荡条件下孵育3～16h，去除液体，获得孵育后的偶联复合物并用PBS缓冲液清洗，获得吸附微囊泡的偶联微球；本发明采用的方法提取的总微囊泡，保留了全部微囊泡的结构和成分，产量高。并且可以进行二次分选，对特定的微囊泡进行分析，提高了提取效率和研究价值。总共的提取时间最少只要4小时，就可以完成微囊泡的提纯，最少5小时可以完成外泌体的提纯。该对比文件公开的方法通过偶联复合物提取微囊泡，虽然可以保留微囊泡的结构和成分，具有较好的生物活性，但是其生物相容性不佳，且上述方法主要适用于肿瘤细胞，普适性也有待提高。

针对相关研究现状，本发明拟提出一种产率高、普适性好、可使生物分子保持较好生物活性的细胞膜仿生微囊泡的制备技术。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种高生物活性细胞膜仿生微囊泡的制备方法，该方法普适性好，制备出来的细胞膜仿生微囊泡产率高且保持较好的生物活性和生物相容性，其具有类似细胞膜的结构和性质，是研究精准药物递送、细胞仿生以及细胞膜结构和性质的理想模型。