[发明专利]一种槲皮素糖苷的生物合成方法

说明书

本发明公开了一种槲皮素糖苷的生物合成方法,将糖基转移酶UGT73G1突变体的基因与蔗糖合酶基因连接得到重组质粒，构建含双酶体系的重组菌；将重组菌接种于LB液体培养基中，培养，添加诱导剂乳糖诱导，发酵液离心收集菌体，菌体破碎，离心收集上清液得到粗酶液；将槲皮素或异槲皮素溶于DMSO中，加入粗酶液、蔗糖，反应，离心得上清槲皮素‑3，4’‑二葡萄糖糖苷。所述糖基转移酶UGT73G1突变体的氨基酸序列是SEQ ID NO:1所示序列发生V371A和/或F381Y突变的氨基酸序列。该突变体制备简单，产量大，实现了槲皮素‑3，4’二葡萄糖糖苷产量的提高。

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种槲皮素糖苷的生物合成方法。

背景技术

槲皮素（Quercetin），又称栎精、槲皮素黄，作为一种天然黄酮类化合物，广泛存在于植物的花、叶、果实中，多以甙的形式存在，具有很好的祛痰、止咳作用。此外还有降低血压、增强毛细血管抵抗力、减少毛细血管脆性、降血脂、扩张冠状动脉，增加冠脉血流量等作用。在美国，槲皮素治疗前列腺癌已是非处方药，但在中国，还没批准该药物作为前列腺治疗药物。槲皮素不溶于水，导入亲水性基团可增加其溶解性，便于吸收，从而增强其药理作用，将槲皮素糖基化是一种增加其溶解性的有效手段。专利201110343655.5报道了利用糖苷酶对槲皮素进行糖基化作用，产量0.148g/L,转化率14.81%.转化率及产量相对较低。目前国内外糖基化合物的研究热点主要是黄酮衍生物的合成，但是由于大多数黄酮苷元及其黄酮苷类在水相中溶解度低，限制了其制剂的开发。槲皮素-3，4’-二葡萄糖糖苷是槲皮素糖基化的产物，比槲皮素有更好的水溶性和药理作用。它存在于洋葱的表皮细胞中，但含量极少，表皮细胞干重含量只有0.2g-7.4g/kg，提取困难。由于槲皮素来源广泛，且芦丁水解成槲皮素和异槲皮素工艺成熟。因此利用微生物转化具有原料优势，便于槲皮素-3，4’-二葡萄糖糖生产的应用。微生物转化法通过一步转化，工艺简单，便于调控，目前国内关于制备槲皮素-3，4’-二葡萄糖糖苷报道较少。

发明内容

本发明的目的是提供一种槲皮素糖苷的生物合成方法；

本发明的另一目的是提供一种糖基转移酶突变体及其制备方法，利用该基因实现槲皮素的糖基化修饰，制备得到槲皮素-3，4’二葡萄糖糖苷，并为工业化生产提供一定的借鉴。

为了实现上述目的，本申请采用的技术方案为：

一种适用于槲皮素糖苷合成的糖基转移酶突变体，糖基转移酶突变体的氨基酸序列是SEQ ID NO:1所示发生突变的氨基酸序列，突变的氨基酸位点选自S151，T168，K274，T293，G361,S365,V371及F381中的一个或多个。

进一步地，突变的氨基酸位点发生的突变包括如下任意一种或多种：S151T，T168S，K274W/E，T293G/V，G361K,S365T,V371A/G,F381Y，其中，“/”表示“或”。

F381Y为SEQ ID NO:1序列中第381位氨基酸由苯丙氨酸（F）突变为酪氨酸（Y）；S151T为ID NO:1序列中第151位氨基酸由丝氨酸（S）突变为苏氨酸（T），T168S为ID NO:1序列中第168位氨基酸由苏氨酸（T）突变为丝氨酸（S），K274W/E为ID NO:1序列中第274位氨基酸由赖氨酸（K）突变为色氨酸（W）或谷氨酸（E），T293G/V为ID NO:1序列中第293位氨基酸由苏氨酸（T）突变为甘氨酸（G）缬氨酸（V），G361K为ID NO:1序列中第361位氨基酸由甘氨酸（G）突变为赖氨酸（K），S365T为ID NO:1序列中第365位氨基酸由丝氨酸（S）突变为苏氨酸（T），V371A为ID NO:1序列中第371位氨基酸由缬氨酸（V）突变为丙氨酸（A）或甘氨酸（G）。

一种表达基因，该基因编码上述任一种糖基转移酶突变体。

一种重组质粒，该重组质粒连接有上述表达基因和蔗糖合酶基因SUS。