[发明专利]一种巢式PCR检测或/和鉴定布鲁氏菌的方法在审

专利信息
申请号: 201811075543.4 申请日: 2018-09-14
公开(公告)号: CN109306372A 公开(公告)日: 2019-02-05
发明(设计)人: 田国忠;姜海;朴东日;赵鸿雁;杨晓雯 申请(专利权)人: 中国疾病预防控制中心传染病预防控制所
主分类号: C12Q1/6848 分类号: C12Q1/6848;C12Q1/04;G16B40/00;C12R1/01
代理公司: 北京思海天达知识产权代理有限公司 11203 代理人: 张立改
地址: 102206 *** 国省代码: 北京;11
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摘要:
搜索关键词: 布鲁氏菌 巢式PCR 检测 分子生物学技术 菌核 标本核酸 结果分析 试验操作 核酸DNA 可检测 组织液 标准化 血液
【说明书】:

一种巢式PCR检测或/和鉴定布鲁氏菌的方法,涉及分子生物学技术领域。本发明巢式PCR技术,既可检测和鉴定纯菌核酸DNA,也可以检测和鉴定组织液和血液等微量布鲁氏菌核酸DNA;不仅可以鉴定待测标本核酸DNA的布鲁氏菌种型,也可以鉴定其生物型。巢式PCR结果分析可以标准化,试验操作简单,具有普通PCR技术的人员就可以完成。

技术领域

本发明涉及分子生物学技术领域,本发明涉及检测和鉴定布鲁氏菌菌株和检测样品 (如:血液、血清、组织液,肝脾等)中布鲁氏菌DNA的巢式PCR技术方法,通过对PCR 扩增产物的测序,鉴定其布鲁氏菌种型和生物型。运用本方法可以快速地从病原学上对布鲁氏菌病感染做出诊断,以及鉴定其布鲁氏菌种型和生物型。

背景技术

布鲁氏菌病(Brucellosis)简称布病,又称地热中海弛张热、马耳他热或波浪热,俗称“懒汉病”,是由细胞内寄生的布鲁氏菌属(Brucella)细菌引起的一种人兽共患传染—变态反应性疾病,布病广泛分布于世界各地。

目前已知有60多种家畜、家禽、野生动物是布鲁氏菌的宿主。与人类有关的传染源主要是羊、牛及猪,其次是犬。病畜的分泌物、排泄物、流产物及乳类含有大量病菌,在动物间传播,造成带菌或发病。人通过接触布病感染的动物、食用布鲁氏菌污染的奶制品以及实验室接触等传播方式引起布鲁氏菌感染。

布鲁氏菌为小球杆状菌,革兰氏染色阴性。本菌侵入机体后,随淋巴液到达淋巴结,被吞噬细胞吞噬。如细菌未被吞噬细胞杀灭,则在胞内生长繁殖,形成局部原发病灶。潜伏期为7-60天,平均15天,少数患者可达数月或1年以上。细菌在吞噬细胞内大量繁殖导致吞噬细胞破裂,随之大量细菌进入淋巴液和血循环形成菌血症。在肝、脾、淋巴结、骨髓等处形成多发性病灶,造成临床上不仅有菌血症、败血症,而且还有毒血症的表现。经一定时期后,感染灶的细菌生长繁殖再次入血,导致疾病复发。如此反复成为慢性感染,慢性期多侵及脊柱和大关节,表现为长期发热(包括低热)、多汗、关节痛兼或肝、脾、淋巴结和睾丸肿大等临床症状及体征。

布鲁氏菌常规检测方法主要有培养方法和虎红平板凝集试验(RBPT)、血清凝集试验 (SAT)、补体结合试验(CFT)、酶联免疫吸附试验(ELISA)等免疫学方法。培养中分离到布鲁氏菌仍然是布鲁氏菌病诊断的“金标准”,但布鲁氏菌分离培养的敏感性低、耗时、费力,而且具有较大的生物安全性危害。免疫学方法目前已经用于布鲁氏菌病的监测和流行病学调查研究中,但由于在感染早期,机体还未产生相关抗体或产生的抗体还未达到检测的限度,得到假阴性结果;而且布鲁氏菌与某些细菌间又存在交叉反应,得到假阳性结果,影响了检测的特异性。

随着分子生物学技术的发展,PCR方法(包括普通PCR和荧光定量PCR)已被用于布鲁氏菌病的辅助诊断和病原体的检测鉴别中。对待检样品中的微量核酸DNA,单一引物的普通PCR和多重PCR方法难以检测,对纯菌DNA,单一引物难以鉴定其布鲁氏菌的生物型,多重PCR方法可以鉴定其生物型,但操作过程复杂,而且对微量DNA不能检测到;荧光定量PCR技术是一种集PCR技术、荧光信号检测和数据分析于一体的核酸定量检测技术。对纯菌DNA具有很高的特异性、灵敏性,准确性及假阳性率低等特点,可以检测到1 个拷贝数的核酸DNA,但是目前荧光定量PCR技术,由于组织液血液中的影响因素众多,导致假阳性率和假阴性率均较高,影响其在组织血液中布鲁氏菌核酸DNA检测中的应用。

本发明巢式PCR技术,既可检测和鉴定纯菌核酸DNA,也可以检测和鉴定组织液和血液等微量布鲁氏菌核酸DNA;不仅可以鉴定到种型,也可以鉴定到生物型,其检测的最低限为1个拷贝的布鲁氏菌核酸DNA,灵敏度等同于荧光定量PCR的水平,而且可以标准化,操作简单,具有普通PCR技术的人员就可以完成。

发明内容

本发明的目的在于提供一种快速、特异的微量核酸DNA布鲁氏菌种型和生物型的检测及鉴定的巢式PCR检测方法。

为实现上述目的,本发明提供如下技术方案:

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