[发明专利]一种选育对马铃薯Y病毒持久抗性的烟草植物的方法

说明书

本发明涉及一种获得对马铃薯Y病毒持久抗性(Durable resistance)烟草植物的方法，将烟草植物包含的eIFiso4E‑T基因敲除(Knockout,KO)，获得eIFiso4E‑T^KO突变体，并将上述突变体与抗PVY野生型病毒的va或eifiso4e‑t^KO基因聚合，可获得烟草对PVY的持久抗性(durable resistance)。本发明所述的方法对于培育抗PVY烟草具有重大应用前景。

技术领域

本发明属于生物技术领域，进一步属于烟草生物技术育种领域，具体涉及一种聚合eIFiso4E-T基因突变体和eIF4E1基因突变体、获得持久抗马铃薯Y病毒的烟草植物的方法。

背景技术

马铃薯Y病毒(Potato virus Y,PVY)是马铃薯Y病毒属(Potyvirus) 的典型成员，主要危害茄科(Solanaceae)作物，是世界十大经济损失严重的植物病毒之一(Scholthofet al.,2011)，也是病毒研究中重要的模式病毒。PVY主要危害马铃薯、烟草、番茄和辣椒等茄科作物，近年来PVY已经上升为烟草上的主要病害，位列十大烟草侵染性病害名单前列(陈瑞泰等,1997；刘勇等,2006)。在同科作物相邻种植的农田生态下，控制一种作物上PVY的发生不仅有利于该作物的病害防治，也有利于其他作物的病害治理。PVY在田间由蚜虫非持久性传播。由于蚜虫发育周期短、繁殖力强和易产生抗药性，利用化学药剂防治媒介昆虫来治理该病害效果有限，因此，种植PVY 抗病品种依然是防控PVY最根本、最经济有效的手段；而对抗病品种的要求是抗性高且抗性持久。

烟草作为重要的经济作物和植物研究重要的模式作物，有关PVY 抗性资源鉴定、抗病育种和病原调查鉴定研究较多。其中通过X-射线诱变获得的va基因抗病资源，已广泛应用于选育烟草抗病品种。烟草Va位点上的eIF4E1基因(有的文献缩写为eIF4E-1，GenBank序列登录号KF155696)缺失或突变导致烟草产生针对PVY的抗性(刘勇等，2013；Julio等，2014)。证据表明eIF4E1蛋白能和PVY的 VPg蛋白互作从而起始病毒功能蛋白的翻译，是PVY侵染植物必需的植物寄主因子。

PVY利用病毒编码的无校正功能的RNA聚合酶复制，RNA病毒基因组复制错误率估计为10^-4-10^-5(Drake等,1998)，病毒复制产生的基因组突变和株系之间的重组导致病毒基因组多样性高，因此通常被描述为“动态群体(dynamic populations)”(Domingo,2002)。在va 基因选择压力下，在广泛种植va抗病烟草品种的法国、巴西等国已经发现可克服va抗性的PVY分离物，并在田间快速上升，在部分田块已经完全失去了对变异病毒的抗性(Lacroix等，2010；2011；2012)。中国连续多年的田间病害调查和温室内连续继代接种中也发现了可克服va抗性的PVY分离物(简称PVY^vaB)，表明在种植va抗病烟草品种的大田中有PVY再次爆发的风险。因此发掘针对抗性突破株系PVY^vaB的抗病基因资源尤为必要。

PVY野生型病毒(以PVY^WT表示)的VPg蛋白第101位和第105 位氨基酸的点突变可克服va抗性(Masuta et al.，1999；Lacroix et al., 2011；Janzac et al.,2014，)PVY和同属其他病毒的VPg蛋白可与寄主不同的eIF4E家族成员互作(Ruffel等，2004；Gauffier等,2016)。本发明申请人提出如下假说：在缺失eIF4E1基因的普通烟草(va) 或者eIF4E1蛋白失去功能的烟草中，抗性突破株系PVY^vaB转而与烟草eIF4E家族其他某个成员互作，完成侵染循环，同时敲除eIF4E1和该成员有望获得PVY持久抗性的育种材料。聚合eif4e1突变材料和该成员突变材料，可获得持久的新抗PVY基因资源和抗病材料。该发明对茄科作物烟草、马铃薯、辣椒、番茄抗PVY育种具有重要的借鉴作用。

发明内容