[发明专利]一种含蛋白质类中药的专属性肽段的鉴别方法

权利要求书

1.鹿皮胶中专属性肽段的鉴别方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）样品制备

正品：不同批次的鹿皮胶；

伪品：不同批次的阿胶、牛皮胶、猪皮胶、马皮胶；

取各种胶类药材粉末1.0 mg，置于1.5ml的EP管中，加入50 mM的Tris缓冲液，pH=8.5，超声提取30分钟，16000g离心15分钟，取上清液，加入胰蛋白酶10 μg，37℃酶解12小时，加入10%TFA终止酶解，16000g离心15分钟，得酶解后的沉淀样品；

（2）然后用Seppak C18脱盐

具体方法为：先用乙腈活化Seppak C18三次，每次1ml，0.1%三氟乙酸溶液平衡3次，每次1ml，上酶解后的样品，0.1% TFA冲洗3次，每次1ml，用0.2% TFA的80%ACN溶液洗脱2次，每次0.8ml，收集洗脱液，离心浓缩干燥，以3%ACN溶液 复溶，备用；

（3）采用Nano LC-MS/MS高通量鉴定肽段序列；

采用戴安U3000 NanoRSLC纳升液相系统，色谱柱为5 μm Reprosil C18AQ，规格75μm× 150 mm，上样量为2 μL，流速400 nL/min，流动相A：体积比为2/0.2/98的乙腈/甲酸/水，流动相B：体积比为80/0.2/20的乙腈/甲酸/水， 2~30%B线性梯度洗脱150 min；Thermo LTQOrbitrap XL质谱仪用于进行肽段分析，喷雾电压为2.5 kV，离子传输毛细管温度为200℃；质谱一级全扫描范围为m/z 300~2000，分离宽度为3 Da；串联质谱分析采用一级质谱数据依赖的二级质谱扫描模式，依次选取一级质谱中离子强度最高的5个离子进行碰撞诱导解离二级串联质谱，采用Xcalibur软件进行数据采集；

二级质谱数据采用PEAKS 8.5软件进行搜库鉴定分析，选择劳亚兽总目的蛋白质数据库，检索参数设置为：前体离子误差10 ppm；子离子误差1 Da；蛋白质翻译后修饰参数设置：半胱氨酸残基固定修饰：氨甲酰甲基化57.02 Da；甲硫氨酸残基可变修饰：氧化+15.99 Da；N-端乙酰化：+42.01 Da；氨基甲酰化：+43.01 Da；允许2个位点误切，假阳性率≤1%；酶切方式选择胰酶：Trypsin或LysC或GluC，唯一肽段数≥2；其他参数为默认参数，在上述检索条件下所得分值有显著性意义，P 0.05，被认定为有效的鉴定结果；鉴定确定每个样品酶解液中所有肽段的氨基酸序列；

（4）根据数学集合理论寻找专属性肽段

将不同批次鹿皮胶鉴定得到的肽段信息取交集，记为集合I，其中共有126个肽段信息，将其它动物阿胶、牛皮胶、猪皮胶、马皮胶皮胶中鉴定得到的肽段信息取并集，记为集合II，其中共有4428个肽段信息，将集合I和集合II相交，在集合II的补集中，共有10个肽段信息，这10个肽段为可能的专属性肽段，这些肽段的序列情况见表1；由表1 可见，只有肽段1：序列为SGETGASGPP(+15.99)GFAGEK和肽段2：序列为GYP(+15.99)GN(+0.98)AGPVGTAGA(+15.99)PGPQGPVGPTGK来源于鹿科动物，而其它的肽段序列来源于多个种属动物的同源蛋白；

表1 目标集合中的10个肽段信息

（5）同源比对确定专属性肽段

将不同种属的同源蛋白序列输入MEGA软件中比对分析，比较肽段1和肽段2在同源蛋白中对应位置的氨基酸序列，肽段1和肽段2为鹿科专属性肽段，在其它物种中，同源蛋白中与肽段1和肽段2位置相对应的氨基酸序列与肽段1、肽段2均有差异。

2、角类动物药中专属性肽段的鉴别方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）样品制备

正品：不同批次的水牛角；

伪品：不同批次的山羊角、马鹿角、猪蹄甲；

取各种角类药材粉末1.0 mg，置于1.5ml的EP管中，加入1 ml 4%SDS的Tris缓冲液溶解，超声提取30分钟，16000g离心15min，加入浓度80%丙酮沉淀4小时后，16000g离心15分钟，弃去上清，用丙酮洗涤2次，离心，将丙酮挥干，加入含有8M尿素的Tris缓冲液溶解，再用Tris缓冲液将溶液中尿素浓度稀释至1M以下，加入10 μg的胰蛋白酶，37℃酶解12小时，加入10%TFA终止酶解，16000g离心15分钟，得沉淀酶解物；

（2）用OMIX C18脱盐：

具体方法为：按如下顺序处理：取乙腈活化固相萃取头OMIX C18吸头，然后用三氟乙酸溶液平衡，然后将步骤（1）的酶解物上固相萃取头OMIX C18，用吸头在样品溶液中反复吹吸，再用0.1% 三氟乙酸冲洗，吸取含0.2% 三氟乙酸的80%乙腈溶液于另一EP管中反复吹吸，收集洗脱液，离心浓缩干燥，以3%ACN溶液 复溶，备用；

（3）采用Nano LC-MS/MS高通量鉴定肽段序列；

采用戴安U3000 NanoRSLC纳升液相系统，色谱柱为5 μm Reprosil C18AQ，规格75μm× 150 mm，上样量为2 μL，流速400 nL/min，流动相A：体积比为2/0.2/98的乙腈/甲酸/水，流动相B体积比为80/0.2/20的乙腈/甲酸/水，2~30%B线性梯度洗脱150 min；Thermo LTQOrbitrap XL质谱仪用于进行肽段分析，喷雾电压为2.5 kV，离子传输毛细管温度为200℃；质谱一级全扫描范围为m/z 300~2000，分离宽度为3 Da；串联质谱分析采用一级质谱数据依赖的二级质谱扫描模式，依次选取一级质谱中离子强度最高的5个离子进行碰撞诱导解离二级串联质谱；采用Xcalibur软件进行数据采集；

二级质谱数据采用PEAKS 8.5软件进行搜库鉴定分析，选择劳亚兽总目的蛋白质数据库，检索参数设置为：前体离子误差10 ppm；子离子误差1 Da；蛋白质翻译后修饰参数设置：半胱氨酸残基固定修饰：氨甲酰甲基化57.02 Da；甲硫氨酸残基可变修饰：氧化+15.99 Da；N-端乙酰化：+42.01 Da；氨基甲酰化：+43.01 Da；允许2个位点误切，假阳性率≤1%；酶切方式选择胰酶：Trypsin或LysC或GluC，唯一肽段数≥2；其它参数为默认参数，在上述检索条件下所得分值有显著性意义，被认定为有效的鉴定结果；鉴定确定每个样品酶解液中所有肽段的氨基酸序列；

（4）根据数学集合理论寻找专属性肽段

将不同批次水牛角鉴定得到的肽段信息取交集，记为集合X，其中共有78个肽段信息，将其它伪品山羊角、马鹿角、猪蹄甲中鉴定得到的肽段信息取并集，记为集合Y，其中共有2796个肽段信息，将集合X和集合Y相交，在集合Y的补集中，共有4个肽段信息，这4个肽段为可能的专属性肽段，这些肽段的序列情况见表2，由表2 可见，4个序列均来源于牛科动物，可见这4个肽段可能均为水牛角的专属性肽段；

表2 水牛角中可能的专属性肽段信息

（5）同源比对确定专属性肽段

将不同种属的同源蛋白序列输入MEGA软件中比对分析，四个肽段均源于水牛角角蛋白74中的序列，其中肽段4的序列包含了肽段3的序列，且与其它物种的同源角蛋白中的序列不同，4个肽段为水牛角中专属性肽段；

（6）LC-QQQ MS验证肽段的专属性

采用液相色谱-串连质谱法，以C18色谱柱为色谱柱，流动相由流动相A和流动相B组成，流动相A为0.1 %甲酸水溶液，流动相B为乙腈，梯度洗脱为：0-5 min，5 %流动相B，5-15min，5-50 %的流动相B，质谱为正离子检测模式，雾化器温度为350℃，雾化器流速为10 L/min，雾化器压力为35 psi，毛细管电压为3500 V，鞘流气温度为350℃，鞘流气流速为12 L/min，毛细管电压为4500 V，和锥孔电压为500 V；采用质谱多反应监测挑选目标肽段的母离子与子离子，在待测样品的液相色谱-串联质谱图中，选择m/z 625.83→558.34、443.22和m/z 686.84→989.45、592.26作为检测离子对进行检测，如果呈现与水牛角对照色谱保留时间一致的质谱峰，则判定所述待测样品为水牛角，如果不出现相应的质谱峰，则判定所述待测样品不是水牛角。