[发明专利]一种提高蓝莓外植体辐射诱变率的方法

权利要求书

1.一种提高蓝莓外植体辐射诱变率的方法，其特征在于，包括：

取蓝莓无菌培养苗，经愈伤组织培养和胚性愈伤组织诱导，在得到胚性愈伤组织后，进行以下操作：

(1)将胚性愈伤组织置于钴⁶⁰半致死剂量的减半剂量进行重复辐射，得到经过多次辐射的胚性愈伤组织；

(2)将经过辐射的胚性愈伤组织继代增殖扩繁，淘汰褐变死亡的部分，获得经过辐射诱变的材料；继续诱导胚性愈伤组织，让其再生成M₀代苗；

(3)培育经辐射诱变的蓝莓组培苗至开花结果，与未经辐射的目标品种进行自然杂交，收获杂交果实，获得以辐射为父母本的M₁代杂交种子；

(4)培育辐射杂交种子，获得辐射杂交苗；优选辐射杂交苗结果后的目标性状；取目标材料进行组培快繁，获得不同目标性状的M₂代蓝莓辐射谱系。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)具体包括：

(1.1)确定蓝莓胚性愈伤组织的钴⁶⁰辐射半致死剂量

将蓝莓胚性愈伤组织置于不同剂量的钴⁶⁰辐射井内进行辐射，辐射后继代于愈伤组织增殖培养基中继代增殖培养，统计致死率，并将致死率45-55％的剂量确定为半致死剂量；

(1.2)蓝莓胚性愈伤组织钴⁶⁰的低剂量反复辐射

将胚性愈伤组织置于减半的半致死剂量钴⁶⁰辐射源中辐射1次，取出后继代于愈伤组织增殖培养基中复壮培养30-40天，再次置于相同剂量的钴⁶⁰辐射源中辐射；重复该操作2-3次，以增加变异率。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述钴⁶⁰辐射半致死剂量为8Gy/min，减半的半致死剂量为4Gy/min。

4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，在对胚性愈伤组织进行辐射前，必须先进行胚性愈伤诱导和组织切片鉴定；复壮培养时，培养容器采用250ml罐头瓶或马铃薯瓶，每瓶接种数量4-5块。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)具体包括：

(2.1)辐射诱变后的胚性愈伤组织增殖扩繁

对经过多次辐射组织，以新鲜的愈伤组织增殖培养基进行继代增殖扩繁；为防止污染和褐变的交叉感染，接种操作时每瓶接种1块材料，继代增殖培养过程中进行暗培养，及时去除褐变和死亡的愈伤组织；

(2.2)辐射诱变后的胚性愈伤组织的再生成苗

将步骤(2.1)中获得的经过扩繁的辐射愈伤组织，接种于胚状体再生培养基，诱导成苗后继代扩繁2-3次，得到M₀代组培苗；其中，胚状体再生培养基的成分为WPM+TDZ 0.1mg/L+ZT 0.5mg/L+IBA 0.1mg/L+活性炭0.5g/L；

(2.3)室内瓶外生根培养

取健壮的蓝莓辐射诱变组培苗M₀代，剪去粘有培养基的下端，扦插于混合生根基质里，室内继代培养条件下，生根培养3-4周；其中，

混合生根基质的配制方法：按体积比2∶1混合苔藓和蛭石后，再按10∶1的重量比例将苔藓-蛭石混合物与生根营养液混匀；

生根营养液的配制方法：配制1L的WPM培养基，加水稀释至5L；继续添加IBA，使溶液中的IBA浓度为10mg/L，调节pH值到4.5；煮沸灭菌后冷却，即得到生根营养液。

6.根据权利要求2或5所述的方法，其特征在于，所述愈伤组织增殖培养基中包括WPM+CPPU 0.5mg/L+ZT 0.5mg/L+番茄汁10g/L。

7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，在步骤(2.1)的继代增殖培养过程中，将生长缓慢的材料和生长旺盛材料分开培养，对于生长缓慢的愈伤组织材料添加双倍激素配比的增殖培养基，其成分包括：WPM+CPPU 1.0mg/L+ZT 1.0mg/L+番茄汁10g/L。