[发明专利]禽法氏囊病毒VP2蛋白的高表达发酵工艺

说明书

本发明公开了一种禽法氏囊病毒VP2蛋白的高表达发酵工艺，旨在解决工程菌禽法氏囊病毒VP2蛋白表达量低的技术问题。该发酵工艺包括以下步骤：（1）菌种活化；（2）种子培养；（3）补料分批发酵：I.细胞快速繁殖阶段：制备基础培养基置于发酵罐中，将二级种子液按4～6%的接种量接入发酵罐中发酵，待溶氧量急剧上升开始补料；II.蛋白表达阶段：加入终浓度为0.5mmol/L诱导剂；加入补料培养基之二，继续发酵至结束即成。本发明的工艺方法蛋白表达量高，能够缩短生产周期、减少设备投资，降低生产成本，提高生产效率，能够极大地提高产品在商场上的竞争力，为IBDV基因工程亚单位疫苗的研制和生产奠定了基础。

技术领域

本发明涉及发酵工程技术领域，具体涉及一种禽法氏囊病毒VP2蛋白的高表达发酵工艺。

背景技术

禽法氏囊病（Infectious Bursal Disease，IBD）是一种急性、高度接触性传染病，主要感染雏鸡的免疫器官法氏囊，引起免疫抑制甚至死亡，该病主要危及3～7周的雏鸡，对禽业影响巨大。

禽法氏囊病是由传染性法氏囊病毒（Infectious Bursal Disease Virus，IBDV）引起的，病毒在感染后迅速侵入法氏囊，并在法氏囊内增殖，使得法氏囊中的B 淋巴细胞裂解、死亡，最终产生严重的免疫抑制。长期的免疫抑制使鸡群容易受到其他病原体的感染，且机体对疫苗的免疫反应力下降，不能正常诱导保护性免疫反应，从而造成免疫失败。IBDV的VP2蛋白是由454个氨基酸组成，分子量约为37 KD，占病毒总蛋白的51%，是IBDV的主要结构蛋白和保护性抗原，也是构成病毒衣壳的主要成分。VP2蛋白可以诱导与识别病毒中和抗体、也影响着病毒的毒力及抗原的变异、还可以诱导细胞凋亡等。因此，生产和科研上均迫切需要大量制备VP2 蛋白，以为 IBDV 的防治和新型亚单位疫苗的研发和生产提供的研究基础。

目前，重组外源蛋白的工业化生产，需要能够高效稳定表达外源基因产物的工程菌，以及能够大规模培养发酵工程菌的技术和工艺。然而，现有研究中工程菌的VP2 蛋白表达量均差强人意，纯化和浓缩需耗费大量人力、物力、财力，难以达到工业化生产应用。

因此，亟需开发一种能够大幅度提高工程菌产量的VP2 蛋白发酵工艺，以期能够缩短生产周期、降低生产成本、提高生产效率，实现禽法氏囊病毒VP2蛋白的工业化和产业化。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种禽法氏囊病毒VP2蛋白的高表达发酵工艺，通过提高工程菌的发酵密度实现禽法氏囊病毒VP2蛋白的高表达。

为解决上述技术问题，本发明采用如下技术研发思路：

发明人长期大量研究总结得出在工程菌的大规模的发酵过程中，外源基因的表达水平和菌体密度决定着重组外源蛋白产物的产量。

所选择的大肠杆菌具有遗传背景清晰、繁殖速度快、培养条件简单、表达产物产量高等优点，且原核表达系统中大规模生产成本较低、遗传背景清晰、重组目的蛋白的表达量高。发明人选择含有质粒 PlysS的BL21(DE3)PlysS菌株，PlysS含有表达T7溶菌酶的基因，能够在降低目的基因的背景表达水平的同时而不影响目的蛋白的表达，该菌株适合表达毒性蛋白以及非毒性蛋白。

除了需要重组菌本身的表达性质稳定高效外，同时还必须保证重组菌的生长和产物表达的最适环境条件，这包括最佳的培养基组成、适宜的培养温度、pH、稳定的比生长速率、适宜的溶解氧和营养物的合理流加等。这些因素都是相互联系的，因此需要对这些条件因素进行综合考虑，找到一个平衡点。发明人选择则高密度培养技术(High cell-densityculture，HCDC)，即通过提高菌体的发酵密度，从而提高产物的比生产率（单位体积单位时间内产物的产量），采用补料分批发酵的方式以提高工程菌发酵密度，并结合长期的实践研究经验，对高密度发酵条件进行了大量的、全面的探索与优化，进而实现提高发酵菌体密度和目的产物水平的目的。

具体采用的技术方案如下：