[发明专利]利用适配体对哈维氏弧菌进行荧光标记和显微识别的方法

说明书

利用适配体对哈维氏弧菌进行荧光标记和显微识别的方法，涉及哈维氏弧菌的荧光标记和显微识别方法。待测样品处理；核酸适配体处理；核酸适配体与菌的结合和洗涤；涂片、固定和染色；荧光显微镜观察。将具有特异性识别哈维氏弧菌的适配体进行荧光标记，然后通过洗涤、染色等步骤，最后通过荧光显微镜实现对哈维氏弧菌的可视化显微识别和鉴定。利用核酸适配体对哈维氏弧菌的特异性识别作用，通过对适配体进行荧光标记，进而实现对哈维氏弧菌的荧光标记，然后通过荧光显微镜来观察核酸适配体与目标菌结合后的荧光，实现对哈维氏弧菌的显微识别和鉴定。

技术领域

本发明涉及一种哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)的荧光标记和显微识别方法，尤其是涉及利用适配体对哈维氏弧菌进行荧光标记和显微识别的方法。

背景技术

中国水产养殖为世界水产业的发展做出了巨大的贡献。但随着海水养殖业迅速发展和集约化养殖规模的逐渐扩大，海水养殖病害也呈多发趋势，每年约有10％的水产养殖动物死于感染性病害，而且相当多的疾病为弧菌感染所导致。因此建立病原弧菌的早期快速检测技术，对预防相应病害的发生和流行就显得极其重要。

哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)是革兰氏阴性菌，菌体呈杆状，极生单鞭毛运动。它广泛存在于海洋环境中，是水产养殖中重要的条件致病菌，主要感染对象是对虾和鱼等，并可通过食物链引起人类食物中毒，危害人类健康。

核酸适配体(Aptamer)是利用体外筛选技术——指数富集配体的系统进化技术(Systemic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment，SELEX)，从核酸分子文库中筛选得到的寡核苷酸片段。经过研究发现，核酸适配体可以折叠成一定的三维空间立体结构，比如：假结、发卡、G-四链体、鼓包等。核酸适配体利用这些特殊的结构位点，通过静电作用、氢键作用、堆积作用、疏水作用和形状匹配等多种相互作用力，能够与靶标物质形成高亲和力复合物，从而实现对靶标物质的特异性识别结合。

发明内容

本发明的目的是提供操作简单，检测快速，大大缩短检测周期，在水产病原弧菌快速检测中具有较好应用前景的利用适配体对哈维氏弧菌进行荧光标记和显微识别的方法。

本发明的具体步骤如下：

1)待测样品处理；

在步骤1)中，所述待测样品处理的具体方法可为：取待测菌悬液样品，6000rpm离心5min，去除上清后用0.9％生理盐水洗涤菌沉淀1次，然后用0.9％生理盐水重悬菌沉淀。

2)核酸适配体处理；

在步骤2)中，所述核酸适配体处理的具体方法可为：取已在5′端标记了荧光基团的哈维氏弧菌的核酸适配体，用2×结合缓冲液稀释配制成3.33nmol/L的溶液，然后在95℃变性30min，再冰浴10min，所述2×结合缓冲液可将20×结合缓冲液用超纯水稀释20倍所得，所述20×结合缓冲液的配制方法如下：分别称取3.725g的氯化钾、5.844g的氯化钠、2.033g的六水合氯化镁(MgCl2·6H₂O)和6.06g的三羟甲基氨基甲烷(Tris-HCl)，然后将称量的物质用超纯水定容至100ml，调节混合溶液的pH值至7.4，再放入4℃冰箱储存、备用；所述5′端标记了荧光基团可为荧光基团异硫氰酸荧光素。

3)核酸适配体与菌的结合和洗涤；