[发明专利]一种针对非洲猪瘟病毒的核酸快速检测方法

说明书

本发明公开了一种针对非洲猪瘟病毒的核酸快速检测方法，包括如下检测方法：材料准备，引物稀释，扩增反应，扩增曲线和溶解曲线获得，判定；本发明的有益效果是：高特异性：6条引物对应目标序列8个特异区域的识别保证了检测反应的高度特异性；高灵敏度：检测反应的灵敏度高，可检测到10个拷贝；操作简单：只要将待测样本、设计的特异引物和反应液混合，上机扩增30分钟即可得到检测结果；使用一个反应管即可检测出样本是否感染了非洲猪瘟病毒，填补了非洲猪瘟核酸快速检测方法的空缺；试剂盒可用于多个检测平台上，不仅可以用在基因快速检测仪和定量PCR仪，也可以用在其他可以提供恒定温度的设备上如金属浴等。

技术领域

本发明属于生物学技术领域，具体涉及一种针对非洲猪瘟病毒的核酸快速检测方法。

背景技术

非洲猪瘟(African swine fever，ASF)是由非洲猪瘟病毒(African swine fevervirus，ASFV)引起的猪的一种烈性、高度接触性传染病。ASF具有高发病率、高死亡率等特点，一旦发生，经济损失巨大；目前缺乏有效疫苗和特异性治疗手段，使ASF成为目前危害养猪业的最严重疫病之一。

ASFV是非洲猪瘟病毒科(Asfarviridae)非洲猪瘟病毒属(Asfi virus)唯一成员，病毒有些特性类似虹彩病毒科和痘病毒科；病毒粒子的直径为175－215纳米，呈20面体对称，有囊膜。基因组为双股线状DNA，大小170－190kb。在猪体内，非洲猪瘟病毒可在几种类型的细胞浆中增殖，尤其是网状内皮细胞和单核巨噬细胞中复制。该病毒可在钝缘蜱中增殖，并使其成为主要的传播媒介。目前对ASF的控制只能依赖于实验室的快速诊断、对发病动物的捕杀，以及采取有效的检疫措施和严格的卫生措施。

目前，ASFV在我国首次爆发，国内多个地区流行，疫情持续扩大。ASFV在我国缺乏有效疫苗和快速病原检测技术，是疫情准确监测和控制存在的重要问题。因此，利用新型病原学检测技术，建立快速检测方法用于ASFV病原快速鉴定是有效、精准防控疫情的技术关键。

发明内容

本发明的目的在于提供一种针对非洲猪瘟病毒的核酸快速检测方法，以解决上述背景技术中提出的ASFV在我国缺乏有效疫苗和快速病原检测技术，是疫情准确监测和控制存在的重要问题，克服现有技术的不足，提供一种基于核酸的快速、准确、灵敏的方法检测猪群是否感染非洲猪瘟病毒的引物组，以及应用上述引物组的核酸快速检测方法。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种针对非洲猪瘟病毒的核酸快速检测方法，包括如下检测方法：

步骤一：材料准备：检测猪是否感染非洲猪瘟的快速扩增引物组，引物组包括：引物1和2干粉、引物3和4干粉、引物5和6干粉，各1OD；反应液组成：反应浓缩液(DNA聚合酶，Buffer，dNTP，MgSO₄，Betain，荧光染料)；构建完成的非洲猪瘟病毒pUC-ASF质粒样本；阴性对照组：不含目的基因反应液；

步骤二：引物稀释：将试剂盒中引物1和2稀释成40uM,引物3和4稀释成5uM,引物5和6稀释成20uM；

步骤三：扩增反应：反应浓缩液15ul、引物组6ul,模本、构建的标准质粒DNA1ul，无菌无核酸酶水3ul；

步骤四：扩增曲线和溶解曲线获得：将步骤三中的反应液混匀，放入定量PCR仪，设置60个循环，循环完成后获得扩增曲线和溶解曲线；或者基因快速检测系统中，65℃、30分钟，获得扩增曲线和溶解曲线；

步骤五：判定：根据步骤四所获得扩增曲线和溶解曲线进行判定。

作为本发明的一种优选的技术方案，所述

引物1：AACGTTGCCAACGTAGTGGATCTGCTCACGATGCCAATCTCATC；