[发明专利]一种拮抗桉树青枯病的芽孢杆菌的筛选方法

说明书

本发明公开了一种拮抗桉树青枯病的芽孢杆菌的筛选方法，包括以下步骤：备选芽胞杆菌分离培养准备,对土壤芽孢杆菌分离纯化培养，或已经获得了分离纯化芽孢杆菌菌株；桉树青枯病原菌的培养及菌培养液的制备；在桉树青枯病菌株培养液基础上加入刃天青盐指示剂，加入各种待测芽孢杆菌样品以建立桉树青枯病病菌混合培养体系；并进行培养12小时；对培养后的桉树青枯病混合培养体系的图像进行颜色特征R值提取；通过对照组和处理组的分析比较以确定测试菌株拮抗桉树青枯病的能力以筛选高效拮抗的芽孢杆菌生防菌。本方法操作简便，无需要进行营养平板上进行桉树青枯病病原菌进行对峙培养，可以快速、高效地筛选出具有拮抗的桉树青枯病的芽孢杆菌。

技术领域

本发明涉及林业生物防治领域，具体涉及一种拮抗桉树青枯病的 芽孢杆菌的筛选方法。

背景技术

桉树是我国南方速生丰产商品林的重要树种，广东、广西及海南 三省是我国桉树人工商品林主产区，种植面积达440万hm2，占我国 桉树人工林总面积的76％。青枯病(Bacterialwilt)是由劳尔氏菌 (Ralstoniasolanacearum)引起的青枯病是一种土传病害，因具有 遗传多样性,其寄主、地理分布、致病性以及生物型均有差异，植株 一旦感病，很难防治。桉树青枯病是我国桉树人工林生产的重要病害， 随着桉树人工林的不断增加，青枯病的发生日趋严重，已成为当前发 展桉树生产的主要障碍之一。青枯病危害严重且控制难度较大，利用 有益生物或其他生物来抑制或消灭有害生物以达到控制植物病害的 目的，是一种绿色、环保的防治方法,因此应用高效拮抗微生物是预 防桉树青枯病发生的有效手段之一。

刃天青是氧化还原反应的指示剂,由于其的氧化态和还原态具有 不同的颜色。当溶液中滴定体系电对的点位改变时，指示剂电对的浓 度也发生改变，因而引起溶液颜色变化。当有溶液中有细菌等微生物 生长繁殖时,其代谢能使刃天青还原，并发生不可逆的颜色改变,从蓝 紫色→红紫色→淡红紫色→粉红色→淡粉红色→白色的颜色变化,很 容易监控或被监控到。根据刃天青的颜色变化判断是否有微生物代谢 活动。

常规拮抗菌的筛选过程比较繁杂，一般来说，拮抗菌的筛选首 先需要对采集来的样品系列稀释后在营养平板上涂布培养，然后把平 板上生长出来的所有细菌一一挑取后在另一个营养平板上纯化，纯化 后再把细菌一一接种到另一种营养平板上和病原菌进行对峙培养，通 过对所有细菌进行拮抗能力的测定最终筛选到拮抗微生物，由于土壤 和植株中微生物种类繁多，而拮抗菌所占的比例又非常少，而且平板 上的好多细菌是同一个菌株，但是依靠菌株形态很难判断是不是同一 个菌，所以在分离细菌、细菌纯化和对峙培养过程需要大量的培养基 和大量的分离、纯化和拮抗能力测定的工作。正是由于这种筛选方法 过程繁琐，效率低，造成没有更多的时间和精力进行广泛的样品采集， 以增加拮抗菌筛选的范围，从而提高筛选到高效拮抗菌的可能性。

传统的芽胞杆菌生防菌筛选方法多是以纯化好的菌株然后与筛 选的微生物进行平板共培养的对峙试验，以确定是否存在抑菌圈，通 过对所有细菌进行拮抗能力的测定最终筛选到拮抗微生物，由于土壤 中微生物种类繁多，而拮抗菌所占的比例又极少，所以在分离细菌、 细菌纯化和对峙培养过程需要作大量的培养基和大量的分离、纯化和 拮抗能力测定等工作。因此采用传统的的这种生防菌筛选方法工作量 大，费时费力，效率低。

发明内容

本发明的目的在于针对传统拮抗桉树青枯病芽孢杆菌筛选繁琐 且效率较低的难题，提供一种拮抗桉树青枯病病菌快速筛选方法，解 决了拮抗桉树青枯病病菌大规模筛选工作量大、时间长的问题。本发 明采用刃天青作为指示剂添加在芽孢杆菌与桉树青枯病病菌混合培 养体系，通过培养后，以常见的数码相机获得其反应体系的图像，通 过提取图像颜色特征和参数比较筛选拮抗菌株。该方法反应体系小、 节省材料时间，且筛选准确率高，为拮抗桉树青枯的芽孢杆菌大规模 筛选提供一条快捷有效的途径。

主要是通过土壤微生物芽孢杆菌与桉树青枯病病原菌相互作用 时的竞争作用及抗生作用等相结合，在较小的培养体系中通过指示剂 颜色反应出芽孢杆菌不同拮抗情况。