[发明专利]一种可用于软骨损伤修复的具有软骨分化潜能的组织工程脂肪干细胞片层的制备方法

说明书

本发明公开了一种可用于软骨损伤修复的具有软骨分化潜能的组织工程脂肪干细胞片层的制备方法，本发明通过制备特定培养体系，采用细胞片层培养技术获取的ASCs片层是含有细胞外基质的完整片状结构，并具有软骨向分化潜能。由于移植到体内的只有由纯细胞构成的组织，避免了支架等载体的使用以及其所带来的不良反应。而ASCs片层保留了细胞外基质，含有离子通道、生长因子受体和连接蛋白等重要的细胞表面蛋白，细胞间可以更好的保持功能的协调一致，具有传统组织工程技术不可比拟的优点。完整的片层结构有利于细胞在移植部位的存留，大大提高了细胞的利用率和转移细胞的活性。

技术领域

本发明属于细胞移植及组织工程修复领域，尤其涉及一种用于软骨修复再生的具有软骨分化潜能的细胞片层的制备方法。

背景技术

软骨由散在的圆形或椭圆形软骨细胞和周围致密的细胞外基质组成，没有血管、神经和淋巴组织结构。软骨细胞的细胞外基质主要由II型胶原蛋白和糖蛋白组成，为软骨组织提供足够的机械强度。软骨的结构特征使其自我修复能力有限。由各种原因引起的关节软骨损伤将导致退行性骨关节炎。目前，组织工程使用的最主要方法是根据组织结构，利用可降解生物材料制备相仿的三维支架，并在其上种植种子细胞，形成支架组织复合物以后将其移植入体内用于替换病变或受损组织。目前，组织工程在软骨，骨骼和血管等的修复领域已取得一定的进展。然而，组织工程的应用也存在一些问题。首先，支架材料需要有可靠的生物相容度，某些生物材料会造成移植部位附近组织出现炎性、坏死等。其次，支架降解后留下的空间通常会被增殖纤维组织填充，产生无功能性的组织。制造功能性组织工程结构存在许多挑战，包括细胞迁移并定植到支架内、受体炎症反应、微量血管形成不足导致大规模移植的能力有限、支架降解与细胞增殖速率不同步，基于单纯支架结合细胞的方法无法产生具有天然复杂组织结构的功能性组织。细胞片层技术保留了细胞连接，内源性细胞外基质，并在各种机械，化学和生物学特性方面模拟细胞微环境，成为细胞移植的新方法。

脂肪来源的间充质干细胞(ASCs)来源充足，易于分离获取和体外培养扩增，无免疫排斥反应，较之于鼻中隔来源的软骨细胞、骨髓来源的间充质干细胞和肌腱来源的干细胞等常用的种子细胞，脂肪来源的干细胞具有更有的软骨分化潜能，已成为组织工程中用于软骨损伤修复理想的种子细胞。由于缺乏足够的细胞密度和信号因子，细胞粘附率低，细胞储存及应用形式问题等缺点，单纯种植干细胞是较难取得良好效果的。ASCs悬液结合支架移植的方法，细胞上架率和细胞密度低，难以形成致密的目标组织。因此，组织工程学要构建出具有致密组织且血供丰富的大块组织，必须解决种子细胞收获和转移方面存在的问题。细胞片层技术已成功应用于骨髓间充质干细胞、上皮细胞等，但利用传统的细胞片层技术较难获取脂肪源间充质干细胞的片层，这对于细胞片层的技术应用及软骨修复的方法造成了极大的限制。抗坏血酸作为一种多羟基化合物，是一种对人体健康至关重要的常见营养素，具有很强的抗氧化性，在胶原蛋白和其他细胞外基质成分的生物合成中起关键作用，并且在整个人体的许多生物反应中充当辅助因子。经抗坏血酸处理后牙周间充质干细胞中的端粒酶活性和端粒酶逆转录酶蛋白水平增加。端粒酶逆转录酶是控制DNA代谢和增殖的关键核蛋白之一，抗坏血酸诱导的细胞片层通过端粒酶活性促进其自我更新和分化潜力。在培养基中添加抗坏血酸可以作为生长促进剂以增加细胞增殖和DNA合成、细胞外基质沉积。同时，有研究显示抗坏血酸能上调Oct4基因的表达，而Oct4对于维持胚胎干细胞的多潜能性和自我更新具有极其重要的作用。细胞片层培养期间，葡萄糖，丙酮酸，异柠檬酸，琥珀酸，丝氨酸和谷氨酰胺大量消耗。葡萄糖、丙酮酸、异柠檬酸、琥珀酸均为糖酵解的原料及中间产物，而丝氨酸作为蛋白聚糖的主要成分，在诱导细胞外基质的合成和分泌中被大量消耗。根据细胞片层的代谢特点，通过特定的培养技术可在一定程度上完整获取含有细胞外基质，生长因子受体，连接蛋白，细胞间连接，离子通道和其他重要细胞表面蛋白的完整细胞片层，甚至是具有特定分化潜能的干细胞片层。进一步的，细胞片层可组装成类似于天然组织的三维结构并直接移植到损伤部位。

发明内容