[发明专利]一种枯草芽孢杆菌重组菌及其应用

说明书

本发明公开了一种枯草芽孢杆菌重组菌及其应用，属于基因工程和发酵工程领域。本发明采用GRAS微生物枯草芽孢杆菌为宿主，以三种地衣芽孢杆菌基因组为模板使用聚合酶链式反应扩增出三种启动子P_blma、P_npu和P_αgly，并将三种启动子与古细菌淀粉普鲁兰酶SMApu的编码基因及载体联接，转化枯草芽孢杆菌宿主菌，得到三株枯草芽孢杆菌重组菌。在合适的培养基中培养本发明的重组菌，生产古细菌淀粉普鲁兰酶，可以提高普鲁兰酶的产率和活性。

技术领域

本发明涉及一种枯草芽孢杆菌重组菌及其应用，具体涉及一种用于表达古细菌淀粉普鲁兰酶的枯草芽孢杆菌重组菌及其应用，属于微生物基因工程及发酵工程领域。

背景技术

淀粉普鲁兰酶(amylopullulanase)，也称为第2种类型的普鲁兰酶(type2pullulanase)，能够催化淀粉和普鲁兰多糖中α-1,6-葡萄糖苷键和α-1,4-葡萄糖苷键的水解；具有(β/α)₇催化结构，在催化反应中，以谷氨酸残基作为亲核基团，隶属于糖苷水解酶GH57家族。古细菌Thermococcus、Pyrococcus、Staphylothermus、Caldivirga和Thermofilum等属的淀粉普鲁兰酶，最适催化反应温度为85-110℃，在淀粉改性、生产麦芽糊精等领域具有较好的应用前景。本发明所涉及的古细菌淀粉普鲁兰酶SMApu来自古细菌Staphylothermus marinus F1。

古细菌生长所需要的培养基成分复杂，培养过程中常常需要较高(或较低)的温度、较强的酸性(或碱性)条件，有些还需要严格的厌氧环境，并释放出有毒的气体。为了研究古细菌淀粉普鲁兰酶，目前主要采用易于培养的微生物大肠杆菌Escherichia coli进行基因重组表达。但是，大肠杆菌是人类的致病菌，生长过程中还会产生内毒素，所以不适于作为食品用酶的宿主菌。枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis不产生内毒素，是一种公认安全(generally recognized as safe，GRAS)的细菌，已成为多种食品用酶的工业生产菌。然而，古细菌具有密码子使用偏好性，表现为古细菌所经常使用的一些氨基酸密码子，而细菌却很少使用；这常常导致古细菌基因在细菌中不能正确表达或者表达量太低。来自糖苷水解酶GH57家族的古细菌淀粉普鲁兰酶基因，也常常由于没有合适的启动子和稳定的载体，而难于在枯草芽孢杆菌中异源表达。

发明内容

为了解决上述问题，本发明的一个目的是提供一种枯草芽孢杆菌重组菌。

为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

一种枯草芽孢杆菌重组菌，其特征在于，所述的重组菌含有P_blma启动子或P_npu启动子或P_αgly启动子，和古细菌淀粉普鲁兰酶SMApu的编码基因，所述的P_blma启动子核苷酸序列如序列表SEQ IDNO.1所示，所述P_npu启动子的核苷酸序列如序列表SEQ IDNO.2所示，所述P_αgly启动子的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.3所示，所述的古细菌淀粉普鲁兰酶SMApu的编码基因核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.4所示。

所述的重组菌的构建方法具体为：