[发明专利]NDRV弱毒株的选育方法及其在制备NDRV活疫苗中的应用

说明书

本发明公开了一种NDRV弱毒株的选育方法及其在制备NDRV活疫苗中的应用。本发明首次将新型鸭呼肠孤病毒株NDRV‑JM85接种SPF鸭胚成纤维细胞(DEF)在5.0％CO₂、32℃和37℃条件下连续交替传代至170代后，选育获得一株遗传性状稳定、安全性好、免疫原性强的NDRV弱毒株，将其命名为NDRV S株，NDRV S株的保藏编号为CCTCC NO：V201850。并应用NDRV S株接种鸭胚成纤维细胞转瓶培养，收获细胞毒加冻干保护剂，冷冻真空干燥，研制成NDRV活疫苗。通过实验证明：本发明的NDRV活疫苗安全，且具有较好的免疫效果和遗传稳定性，可有效预防新型鸭呼肠孤病毒病。

技术领域

本发明涉及新型鸭呼肠孤病毒(NDRV)弱毒疫苗株的选育方法及其在研制活疫 苗中的应用，属于兽用生物制品学领域。

背景技术

2005年以来，在中国福建、广东、江苏、山东和渐江等省(地)的番鸭、半番鸭、 樱桃谷鸭和麻鸭群发生一种以肝脏不规则坏死和出血混杂为主要特征的疫病(俗称“鸭 出血坏死性肝炎”)，该病无明显季节性，各品种鸭(如番鸭、半番鸭、麻鸭、北京 鸭等)均可发生，并有逐年增加的趋势；发病日龄约为3～25日龄，其中以5～l0日 龄居多，病程为5～7天，发病率为5～20％，死亡率为2～15％，日龄愈小或并发感 染时其发病率和死亡率愈高；由于病原不明，给养鸭业造成较大的经济损失。

为有效防控该病，福建省农业科学院畜牧兽医研究所动物病毒研究室开展了病原、 诊断和防控技术研究，对分离毒株进行了全面系统鉴定，从病毒理化生物学、动物回归试验、基因组特性及分子水平上首次证实鸭出血坏死性肝炎的病原是一种有别于番 鸭呼肠孤病毒(MDRV)和禽呼肠孤病毒(ARV)的一种新型鸭呼肠孤病毒(Novel DuckReovirus，NDRV)(陈少莺等，病毒学报，2010)，并建立了能快速准确诊断该病的 RT-PCR方法(王劭等)。在此基础上开展弱毒株选育及其应用研究。

发明内容

本发明的目的是提供一种人工致弱新型鸭呼肠孤病毒(NDRV)获得弱毒疫苗株 的方法及其在研制NDRV活疫苗中的应用。

第一方面，本发明保护一种新型鸭呼肠孤病毒弱毒株的选育方法。

本发明提供的新型鸭呼肠孤病毒弱毒株的选育方法包括将新型鸭呼肠孤病毒在温 度甲的条件下和温度乙的条件下连续交替传代培养的步骤；

所述温度甲可为37.0-37.5℃；所述温度乙可为32.0-32.5℃。

上述方法中，所述连续交替传代培养的方法如下：

1)将所述新型鸭呼肠孤病毒株接种至细胞中，在所述温度甲的条件下进行传代培养，当细胞病变达到75-80％时，冻融，收集细胞毒株，并将其记作毒株1；

2)将所述毒株1接种至细胞中，在所述温度乙的条件下进行传代培养，当细胞病变达到75-80％时，收集细胞毒株，冻融，并将其记作毒株2；

3)将所述毒株2接种至细胞中，在所述温度甲的条件下进行传代培养，当细胞病变达到75-80％时，收集细胞毒株，冻融，并将其记作毒株3；

4)将所述毒株3接种至细胞中，在所述温度乙的条件下进行传代培养，当细胞病变达到75-80％时，冻融，收集细胞毒株，并将其记作毒株4；

5)按照上述方法连续交替传代培养，直至得到遗传性状稳定、安全性好且免疫原性强的新型鸭呼肠孤病毒株，即为所述新型鸭呼肠孤病毒弱毒株。

上述方法中，所述温度甲具体可为37℃；所述温度乙具体可为32℃。

上述方法中，病毒株的遗传性状稳定性、安全性和免疫原性均可通过现有技术中的常规方法进行测定。