[发明专利]猪传染性胃肠炎病毒荧光定量RT-PCR检测的引物、探针及方法在审
| 申请号： | 201811095869.3 | 申请日： | 2018-09-19 |
| 公开（公告）号： | CN109762931A | 公开（公告）日： | 2019-05-17 |
| 发明（设计）人： | 李守军;白伟杰;郭慧娟;张桂红;吕茂杰;郁宏伟;张英 | 申请（专利权）人： | 天津瑞普生物技术股份有限公司 |
| 主分类号： | C12Q1/70 | 分类号： | C12Q1/70;C12Q1/6851;C12N15/11;C12R1/93 |
| 代理公司： | 天津合正知识产权代理有限公司 12229 | 代理人： | 陈松 |
| 地址： | 300308 天津市滨海*** | 国省代码： | 天津;12 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 猪传染性胃肠炎病毒 荧光定量 探针 引物 荧光定量RT-PCR 优化反应条件 特异性引物 保守序列 变异系数 标准曲线 扩增曲线 设计合成 线性关系 样本检测 猪源病毒 准确检测 高通量 检测 重复 应用 | ||
1.一组猪传染性胃肠炎病毒荧光定量RT-PCR检测的引物和探针，其特征在于，所述引物序列为：
正向引物：5'-GCTTGGTAGTCGTGGTGCT-3'(SEQ ID No.3)；
反向引物：5'-TGGATTGTTGCCTGCCTC-3'(SEQ ID No.4)；
所述探针的序列为：
5'-FAM-AAATTCGATGGTAAAGTGCCAGGCG-TAMRA-3'(SEQ ID No.5)。
2.猪传染性胃肠炎病毒TaqMan荧光定量RT-PCR检测的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含权利要求1所述的引物和探针。
3.权利要求1所述的引物和探针在定量检测猪传染性胃肠炎病毒中的应用。
4.权利要求2所述的试剂盒在定量检测猪传染性胃肠炎病毒中的应用。
5.猪传染性胃肠炎病毒荧光定量RT-PCR检测方法，其特征在于，包括以下几个步骤：
(1)提取待测样品中的RNA，设置阴性对照；
(2)制备DNA标准品；
(3)使用权利要求1所述的引物和探针对待测样品进行TaqMan荧光定量RT-PCR扩增反应；
(4)结果检测：通过荧光定量PCR仪自带软件读取相应的Ct值，判定待测样品阳性或阴性。
6.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于，引物浓度为0.2mol/L，探针浓度为0.2mol/L。
7.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于，步骤(3)中扩增反应体系为：2×RT-PCR Buffer 12.5μl，Ex Taq HS 0.5μl，PrimeScript RT Enzyme 0.5μl，正向引物0.5μl，反向引物0.5μl，探针0.5μl，无RNA酶水8μl。
8.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于，步骤(3)中扩增反应具体为：取步骤(1)中的RNA 2μl和阴性对照2μl分别加入总量为25μl的反应体系中，将配置好反应体系的PCR管于42℃预热5min，95℃预变性10s，95℃变性5s，60℃退火延伸30s，变性与退火过程延伸共40个循环。
9.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于，所述待测样品阳性或阴性的判定标准为：
(1)阳性：检测样品Ct值≤35.0，且扩增曲线有明显的指数增长期；
(2)可疑：检测样品Ct值＞35，且出现典型的扩增曲线，进行重复试验；
(3)阴性：检测不到样品Ct值，且无明显的扩增曲线。
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