[发明专利]一种提高猪胰岛素纯度和收率的分离纯化方法

权利要求书

1.一种提高猪胰岛素纯度和收率的分离纯化方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤1：猪胰岛素的提取，包括以下步骤：

1.1：提取新鲜的猪胰组织并搅碎；

1.2：将搅碎的所述猪胰组织通过提取液提取两次或两次以上，以得到浸出液；

1.3：对所述浸出液进行去除杂蛋白和脂肪的处理，以得到澄清的浓缩液；

1.4：调节所述澄清的浓缩液的pH，向所述浓缩液内加入精盐，静置沉淀；

1.5：过滤出所述浓缩液内沉淀物，将所述沉淀物进行除脂肪和脱水处理；

1.6：将所述沉淀物真空干燥得到初提取物；

步骤2：猪胰岛素的粗纯化，包括以下步骤：

2.1：通过酸水溶解所述初提取物；

2.2：分离出所述酸水中的胰岛素沉淀；

2.3：将所述胰岛素沉淀溶解于酸中，以形成混合溶液；

2.4：对所述混合溶液进行结晶；

2.5：提取结晶物进行洗涤和真空干燥处理，得到猪胰岛素粗品；

步骤3：猪胰岛素的精细纯化，包括以下步骤：

3.1：将所述猪胰岛素粗品完全溶解于pH＝3.5-4.5的醋酸铵缓冲溶液中；

3.2：通过pH＝3.5-4.5 50-250mM醋酸铵缓冲溶液平衡反相色谱柱；

3.3：将步骤3.1中所述醋酸铵缓冲溶液过滤后上样至平衡好的所述反相色谱柱，进行处理；

3.4：通过线性梯度增加有机溶剂浓度的方式纯化目标蛋白，以得到目标蛋白馏分；

步骤4：对所述目标蛋白馏分依次进行除盐、除有机溶剂处理、离心和取沉淀干燥的处理，得到胰岛素纯品粉末。

2.根据权利要求1所述的提高猪胰岛素纯度和收率的分离纯化方法，其特征在于，在步骤1.2中，所述提取液为酸性乙醇溶液；在步骤1.3中，对所述浸出液进行去除杂蛋白和脂肪的处理包括:向所述浸出液内添加氨水，使pH达到8.0-8.8后，将所述浸出液过滤得到滤液，向所述滤液中添加硫酸调节pH至2.5-3.0；在0℃的情况下放置使酸性杂蛋白沉淀，分取清液，将所述清液进行真空浓缩，使浓缩液浓缩至原体积到1/7-1/9，将所述浓缩液在10min内迅速加温至50℃立即用冰冷却至0℃，放置3h，将上层脂肪分离；在步骤1.4中，调节所述澄清的浓缩液的pH达2.0-3.0，在20-25℃下搅拌加入所述澄清的浓缩液容积25％的精盐；在步骤1.5中，所述沉淀物通过污水丙酮的洗涤进行除脂肪和脱水处理。

3.根据权利要求1所述的提高猪胰岛素纯度和收率的分离纯化方法，其特征在于，在步骤2.2中，分离出所述酸水中的胰岛素沉淀包括，向酸水中加入冷丙酮、通过氨水调节pH至4.0-4.2，再加入冷丙酮，静置沉淀后过滤取滤液；滤液通过氨水调节pH至4.0-4.2，加入氯化锌，静置沉淀后抽滤，合并两次沉淀得到胰岛素粗纯品。

4.根据权利要求1所述的提高猪胰岛素纯度和收率的分离纯化方法，其特征在于，在步骤2.3中，每克所述胰岛素沉淀用50-60ml 20％枸椽酸溶解。

5.根据权利要求1所述的提高猪胰岛素纯度和收率的分离纯化方法，其特征在于，在步骤2.4中，向所述混合溶液中加入固体氯化锌和丙酮，搅拌均匀后，调节pH至6.0-6.2，0℃情况下析出结晶。

6.根据权利要求1所述的提高猪胰岛素纯度和收率的分离纯化方法，其特征在于，在步骤2.5中，通过丙酮和乙醚对所述结晶物进行清洗。