[发明专利]一种利用母猪尿液确定母猪妊娠的检测方法

权利要求书

1.一种利用母猪尿液确定母猪妊娠的非疾病诊断治疗为目的的检测方法，其特征在于操作步骤如下：

（1）配种母猪的尿液收集

采集1ml配种后10天以上的待检母猪尿液；

同时采集1ml公猪尿液作为阳性对照样本，采集1ml未配种母猪尿液作为第一阴性对照样本，超纯水作为第二阴性对照样本；

（2）离心

将收集的待检母猪尿液、未配种母猪尿液、公猪尿液分别离心处理，离心条件：转速12000转/分、时间10分钟，取上层透明液体50ul，分别得到离心待检母猪尿液、离心未配种母猪尿液和离心公猪尿液；

（3）设计一对特异性引物

根据猪Y染色体上的性别决定因子SRY基因序列，用Primer 5.0软件设计一对特异性引物，上游引物SRY-F和下游引物SRY-R序列如下：

上游引物SRY-F:CTCAGGAACAGAAAGCCAG

下游引物SRY-R: TGGATGTTACCCTACTGTGG

（4）聚合酶链式反应

A、配制四种聚合酶链式反应体系

先配制预混剂，预混剂共76ml，包括10 mmol/ml SRY基因的上游引物1.6ml、10 mmol/ml SRY基因的下游引物1.6ml、4×dNTP 2.5 mmol/ l脱氧核苷三磷酸8ml、10U/ml Taq 聚合酶2ml、含20 mmol/l氯化镁MgCl₂的10×聚合酶链式反应（PCR）缓冲液8ml和超纯水54.8ml；

待检母猪尿液聚合酶链式反应体系由19ml预混剂和1ml离心待检母猪尿液组成；

阳性聚合酶链式反应体系由19ml预混剂和1ml离心公猪尿液组成；

第一阴性聚合酶链式反应体系由19ml预混剂和1ml离心未配种母猪尿液组成；

第二阴性聚合酶链式反应体系由19ml预混剂和1ml超纯水组成；

B、聚合酶链式反应

对四种聚合酶链式反应体系分别进行聚合酶链式反应；分别得到待检母猪扩增产物、阳性扩增产物、第一阴性扩增产物和第二阴性扩增产物；

步骤（4）中，聚合酶链式反应条件如下：

①95 ℃预变性4 分钟，

②95 ℃变性20秒，

③退火温度：SRY基因为60℃20秒，

④72 ℃延伸30秒，

⑤重复第②～④步骤40个循环，

⑥72 ℃延伸5分钟，最后降温至4℃保存，得到扩增产物；

（5）SRY基因扩增产物的检测

对四种扩增产物分别进行琼脂糖凝胶电泳检测，判定母猪是否妊娠；

若阳性扩增产物经电泳后含有116bp片段，第一阴性扩增产物和第二阴性扩增产物均无116bp片段，待检母猪扩增产物经过凝胶电泳后检测含有116bp片段的个体说明该待检样本的母猪已经妊娠；

若待检母猪扩增产物无SRY基因116bp片段，同时阳性扩增产物含有116bp片段，第一阴性扩增产物和第二阴性扩增产物无116bp片段，说明该待检母猪没有妊娠；

若待检样本无SRY基因116bp片段，同时阳性对照样本也没有116bp片段，2个阴性对照样本也无116bp片段，说明该聚合酶链式反应或凝胶电泳过程失败，需要重新进行聚合酶链式反应和琼脂糖凝胶检测；

步骤（5）中，琼脂糖凝胶电泳检测操作如下：

将6μl扩增产物用浓度2.0%的琼脂糖凝胶电泳40分钟；电泳条件：常温，电压120V，得到含扩增产物的凝胶，将含扩增产物的凝胶置于凝胶成像系统下观测。