[发明专利]一种基于转录组测序开发叶子花SSR引物的方法

权利要求书

1.一种基于转录组测序开发叶子花SSR引物的方法，其特征在于,包括如下步骤：

(1)转录组测序：对叶子花的叶片、苞片、嫩梢、花朵等量混合后进行转录组测序；

(2)筛选SSR位点：基于叶子花转录组测序数据，用SSR Hunter1.3寻找微卫星；

(3)引物设计：采用Primer 5进行引物设计与评价，设计引物时设置的主要参数为:GC含量40％～70％，退火温度55～60℃，引物长18～25bp，预期扩增产物长度120～250bp，且无二级结构和二聚体；

(4)SSR体系建立与检测：

从设计的批量引物中挑选引物对进行合成，以24个叶子花品种的基因组DNA为模板，采用PCR程序进行扩增，扩增产物经毛细管电泳，对可扩增出特异性条带的引物进行筛选，筛选出多态性的SSR引物。

2.根据权利要求1所述的基于转录组测序开发叶子花SSR引物的方法，其特征在于，寻找微卫星的搜索标准为：重复单元长度为2～4bp，重复次数大于等于5次，单核苷酸重复次数大于等于10次；二核苷酸重复次数大于等于6次；三、四、五、六核苷酸重复次数大于等于5次。

3.根据权利要求1所述的基于转录组测序开发叶子花SSR引物的方法，其特征在于，SSR体系建立包括PCR反应体系和PCR反应程序：

PCR反应体系：10μL PCR反应体系中primers(5uM)0.5～0.8μL，10×PCR Buffer 1～1.1μL，dNTP(10mM)0.8～1.2μL，Taq酶(5U/μL)0.10～0.14μL，DNA模板0.8～1.2μL，添加ddH2O至10μL；

PCR反应程序：94度预变性2～3分钟，94度变性30～40秒，58～60℃退火30秒，72度延伸30秒，以后每个循环依次降低0.5～1度，直到50～55度，共5～10个循环；94度变性30秒，52～55度退火30秒，72度延伸30秒，共35个循环；最后72度延伸5分钟。

4.根据权利要求1所述的基于转录组测序开发叶子花SSR引物的方法，其特征在于，SSR体系建立包括PCR反应体系和PCR反应程序：

PCR反应体系：10μL PCR反应体系中primers(5uM)0.6μL，10×PCR Buffer 1μL，dNTP(10mM)0.8μL，Taq酶(5U/μL)0.12μL，DNA模板1μL，添加ddH2O至10μL；

PCR反应程序：94度预变性2分钟，94度变性30秒，60℃退火30秒，72度延伸30秒，以后每个循环依次降低1度，直到50度，共10个循环。94度变性30秒，55度退火30秒，72度延伸30秒，共35个循环。72度延伸5分钟。

5.利用权利要求1所述的基于转录组测序开发叶子花SSR引物的方法获得的叶子花SSR引物，其特征在于，获得的SSR引物序列如SEQ ID No.1-32所示。