[发明专利]一种混合菌株发酵液及其制备和应用

说明书

本发明属于生物农药技术领域，具体涉及一种混合菌株发酵液及其制备和应用。通过制备一种混合菌株发酵液，该混合菌株发酵液是由解淀粉芽孢杆菌发酵液和长枝木霉T6菌株发酵液按体积比为1:1‑3的比例混合制备得到，有效地起到了防治苹果斑点落叶病的效果。

技术领域

本发明属于生物农药技术领域，具体涉及一种混合菌株发酵液及其制备和应用。

背景技术

苹果斑点落叶病主要危害苹果叶片，造成苹果叶片早期脱落，树势衰弱。该病在我国苹果产区普遍发生，严重影响苹果产量和品质，已经成为制约苹果产业发展的重要因素。目前，苹果斑点落叶病以化学药剂防治为主，常用药剂包括多抗霉素、苯醚甲环唑、异菌脲、代森锰锌、多菌灵和醚菌酯等，但是化学药剂防治容易造成环境污染、农药残留和抗药性等一系列问题，而生物防治因其具有高效低毒的特点而日益受到国内外学者的重视。目前，国内外有关利用复合菌协同防治植物病害已有相关报道。据报道，木霉菌对多种植物病原真菌具有较好的拮抗作用，如丝核菌属(Rhizoctonia spp.)、镰刀菌属(Fusarium spp.)、腐霉菌属(Pythium spp.)和小核菌属(Sclerotium spp.)等。同时，解淀粉芽孢杆菌广泛存在于自然界中，因其具有生长速度快、次生代谢产物丰富、利用价值高和对人畜安全等优点，目前已作为一类非常具有潜力的生防菌资源广泛应用于工业、医药和农业生产中，但是已有研究表明单一的微生物菌株对植物病害的防治存在防治范围窄、效果低和防治效果不稳定，以及对环境的适应性和抗逆性较差等弊端。因此，研制混合菌株发酵液有效控制植物病害已成为目前国内外的研究热点，但是国内外关于防治苹果斑点落叶病的复合微生物制剂的研究尚未报道。

发明内容

针对上述问题和现有技术的不足，本发明提供了一种混合菌株发酵液，该混合菌株发酵液是由解淀粉芽孢杆菌发酵液和长枝木霉T6菌株发酵液按体积比为1:1-3的比例混合制备得到。

进一步地，所述的混合菌株发酵液是由解淀粉芽孢杆菌发酵液和长枝木霉T6菌株发酵液按体积比为1:3的比例混合制备得到。

本发明还提供了上述的一种混合菌株发酵液的制备方法，该方法包括以下步骤：

①长枝木霉T6菌株发酵液的制备：在PDA平板上活化培养6d的长枝木霉T6菌株菌落中加入5-6mL无菌水,利用无菌的小毛笔刷取其分生孢子，并使其充分脱落在无菌水中，即得到分生孢子悬浮液的原液。然后，利用血球计数板计数原液浓度，并使其浓度为1.0×10⁷个/mL，放置4℃冰箱保存备用；

取上述孢子悬浮液1mL加入到已灭菌的100mL PDB培养液中，置于30℃摇床，180rpm/min，培养5d后，经温度为4℃，速率为8000rpm/min的离心机离心20min,并经双层无菌滤纸过滤2次。然后，过滤后的滤液通过0.22μm孔径的微孔滤膜过滤器过滤2次除去菌丝和孢子，获得无菌发酵液，放置4℃冰箱备用；

②解淀粉芽孢杆菌发酵液的制备：用已消毒的接菌环取一环活化好的解淀粉芽孢杆菌的单菌落，放入已灭菌的NB培养液中，置于30℃摇床，180rpm/min，培养3d后，经温度为4℃，速率为8000rpm/min的离心机离心20min,并经双层无菌滤纸过滤2次。然后，过滤后的滤液通过0.22μm孔径的微孔滤膜过滤器过滤2次，过滤后上清液，放置4℃冰箱备用；

③混合菌株发酵液的制备：将上述步骤①和步骤②制备的解淀粉芽孢杆菌发酵液和长枝木霉T6菌株发酵液按体积比为1:1-3的比例混合制备得到混合菌株发酵液。

进一步地，所述方法的步骤③中解淀粉芽孢杆菌发酵液和长枝木霉T6菌株发酵液的体积比为1:3。

另外本发明还提供了上述的一种混合菌株发酵液在防治苹果斑点落叶病中的应用。

另外本发明还提供了由上述的一种混合菌株发酵液的制备方法制备得到的混合菌株发酵液在防治苹果斑点落叶病中的应用。