[发明专利]一种利用酵母孢子固定化半纤维素酶的方法

权利要求书

1.一种利用酵母孢子固定化半纤维素酶的方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)提取枯草芽孢杆菌的基因组DNA，分别经PCR扩增，获得木聚糖酶xynA基因和信号肽Epr基因；所述PCR扩增的上、下游引物核苷酸序列如下：

xynA基因扩增引物

上游引物：5'-CAGGATCCTTCTCAAGGAACGATCAG-3'；

下游引物：5'-TTGAGCTCACGAGTGCTACCTCAAAG-3'；

Epr基因扩增引物

上游引物：5'-CGGAATTCATGAAAAACATGTCTTG-3'；

下游引物：5'-TTGGATCCATAACCTCTTTCTCGC-3'；

(2)将步骤(1)得到的半纤维素酶表达基因xynA和信号肽基因Epr分别插入到氨苄抗性质粒pRS424中，经鉴定，制得重组质粒pRS424-xynA-Epr；

(3)将步骤(2)制得的重组质粒pRS424-xynA-Epr转化酿酒酵母OSW2Δ缺陷型菌株，经含氨苄的SD-Trp缺陷性平板筛选，制得重组酿酒酵母；

(4)将重组酿酒酵母接种至SD-Trp培养基中，28℃～32℃振荡培养12～16h；然后转接至YPAce培养基中，28℃～32℃振荡培养12～16h，制得菌液；

(5)离心步骤(4)的菌液收集细胞，清洗，转接至质量百分比浓度1.5％～3％醋酸钾溶液中，28℃～32℃振荡培养24h～48h，使酿酒酵母细胞繁殖子囊孢子，制得孢子菌液；

(6)离心步骤(5)的孢子菌液，收集菌体，用PBS缓冲液洗涤2～3次，然后用PBS缓冲液重悬细胞；向细胞悬浮液中加入Lyticase溶壁酶处理1～1.5h后，冰浴超声波破碎；用PBS溶液洗涤破碎细胞2～3次，弃去上清液，分离纯化，制得游离状态的重组酿酒酵母孢子；

(7)将步骤(6)制得的游离状态的重组酿酒酵母孢子采用海藻酸钠包埋固定法固定，制得固定化酶颗粒。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中，木聚糖酶xynA基因和信号肽Epr基因的PCR扩增体系均如下所示，总体积50μL：

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中，xynA基因的PCR扩增程序如下：

95℃预变性10min；94℃变性35sec，57℃退火35sec，72℃延伸35sec，35个循环；72℃延伸10min，4℃保存；

优选的，所述步骤(1)中，Epr基因的PCR扩增程序如下：

95℃预变性10min；94℃变性35sec，63℃退火35sec，72℃延伸35sec，35个循环；72℃延伸10min，4℃保存。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中，鉴定的具体步骤如下：

将重组后的质粒转入大肠杆菌DH5α，用含氨苄浓度60ug/mL的LB液体培养基过夜培养，提取质粒，用内切酶BamH I和Sac I、EcoR I和BamH I分别进行酶切鉴定，检测酶切片段大小。