[发明专利]一种大量表达抗真菌蛋白的方法

说明书

本发明公开了一种大量表达抗真菌蛋白的方法，根据Aspergillus giganteus的抗真菌基因序列，选取成熟肽的外显子序列，经过OptimumGene^TM Codon Optimization软件进行大肠杆菌最适密码子的优化，并以人工合成的方式获得DNA序列，再将此人工合成序列接合于大肠杆菌的表达质粒pET23a，转化至大肠杆菌中，此优化的基因序列可在大肠杆菌中大量表达生产，经过纯化后的蛋白质，对于真菌同样具有明显的抗菌能力。

技术领域

本发明涉及一种可大量表达抗真菌蛋白的方法。

背景技术

天然抗菌剂种类非常多样化，其来源有来自微生物、植物及动物等，由于天然抗菌剂拥有天然无毒、广普及绿色环保等优势，近几年天然抗菌剂的开发已成为全球发展新药的新趋势。微生物源的抗菌剂除了包含在医疗上长期使用的抗生素之外，多肽类抗菌剂其具有无毒及高效的特，已成为目前研究的热点。多肽类抗菌剂包含有防御素、蜕皮素、黑芥子硫酸苷酶及转脂蛋白等小分子抗菌蛋白质，其中防御素具有反平行β折叠的桶状结构及6至8个半胱氨酸形成的二硫键，拥有较高的稳定性，作为开发药物一大优势。目前已自真菌中发现多种不同的防御素抗菌蛋白质，此类抗真菌蛋白质多从曲霉菌属、青霉菌属及新萨托菌属中克隆出来，因此，皆具有完整的基因序列，Hagen等人(2007)的研究更发现抗真菌蛋白AFP拥有几丁质结合域的保守氨基酸序列，会抑制细胞壁几丁质的合成，造成细胞壁的缺失。然而抗真菌蛋白PgAFP则无此保守氨基酸序列，且根据之前的研究显示PgAFP会干扰细胞信号转导与诱导细胞凋亡，显然抗真菌蛋白质在抑制真菌上具有不同的机理反应。

利用基因工程方法大量表达生产抗真菌蛋白质的研究较少，国内以萝卜抗真菌蛋白作为研究材料较多，在大肠杆菌中能成功表达出具有抑菌活性的蛋白质。徐军等人则是从巨大曲霉菌中将抗真菌蛋白基因转化至绿色木霉菌中，产生的抗真菌蛋白质同样具有抑制真菌的功效。国外在抗真菌蛋白异源表达上的研究不多，主要研究是将萝卜及绿色木霉抗真菌蛋白基因转化至酵母菌(Saccharomyces cerevisiae及Pichia pastoris)，两种抗真菌蛋白质能分别在不同的酵母菌中表达。然而，Wnendt等人(1994)自Aspergillusgiganteus中发现的抗真菌基因 (NCBI accession number:X60771)，将其基因转化到Aspergillus niger，发现转化株的抗真菌蛋白表达产量极低，造成应用上的困难。

发明内容

本发明根据Aspergillus giganteus的抗真菌基因序列(NCBI accessionnumber:X60771)，选取成熟肽的外显子序列经过OptimumGene^TM Codon Optimization软件进行大肠杆菌最适密码子的优化分析，将优化后的基因序列(SEQ ID NO：1)委托GeneDireX(美国)公司以人工合成方式获得，之后同样委托GeneDireX公司将优化后的基因(SEQ IDNO：1)与质粒pET23a (Novagen，美国)进行接合反应，获得可以在大肠杆菌表达的质粒(SEQID NO：2)。此优化后的序列(SEQ ID NO：1)与原始的序列(NCBI accession number:X60771)相似度为84％，共有24 个密码子经过修改优化(图1)，优化后的DNA序列再建构于质粒pET23a上，获得一表达质粒 pAFP-opt(图2以及SEQ ID NO：2)。将质粒pAFP-opt(SEQID NO：2)转化至大肠杆菌中，产生的蛋白质进一步以SDS-PAGE及蛋白质印迹(westernblotting)进行分析，从结果可发现经过优化后的序列在大肠杆菌中可以大量的表达(图3)。将表达纯化后的抗真菌蛋白以纸片扩散法(Disc diffusion method)分析抗真菌能力，结果发现30μg的抗真菌蛋白对Paecilomyces formosus(GIM 3.612)真菌具有明显的抑制作用，并且随着浓度增加，抑制真菌的透明圈就越明显(图4)。

附图说明

下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。