[发明专利]利用密西根克雷伯氏菌合成2’-脱氧-2-氨基腺苷的方法

说明书

本发明公开了利用密西根克雷伯氏菌合成2'‑脱氧‑2‑氨基腺苷的方法，属于生物发酵技术领域。该工艺利用密西根克雷伯氏菌为菌种，利用该菌株湿菌体为酶源将胸苷和2,6‑二氨基嘌呤一步转化为2'‑脱氧‑2‑氨基腺苷。与其他工艺相比，本发明反应体系为纯化水、合成液中各个组分明确，利用该方法得到的2'‑脱氧‑2‑氨基腺苷易提取，产品质量高，成本低廉且易操作适合工业化，成品含量≥99.9%，具有明显市场竞争力。

技术领域

本发明属于生物医药中生物发酵技术领域，涉及嘌呤脱氧核苷的生物合成，具体涉及利用密西根克雷伯氏菌合成2'-脱氧-2-氨基腺苷的方法。

背景技术

克雷伯氏菌属(Klebsiella)为革兰氏阴性杆菌。主要有肺炎克雷伯氏菌(K.peneumoniae)、臭鼻克雷伯氏菌(K.ozaenae)和鼻硬结克雷伯氏菌(K.rhinoscleromatis)。生物学性状：为较短粗的杆菌，大小0.5-0.8×1-2um,单独、成双或短链状排列。无芽胞，无鞭毛，有较厚的荚膜，多数有菌毛。营养要求不高，有普通琼脂培养基上形成较大的灰白色粘液菌落，以接种环挑之，易拉成丝，有助鉴别。在肠道杆菌选择性培养基上能发酵乳糖，呈现有色菌落。

具有O抗原与K抗原，后者用以分型。利用荚膜肿胀试验，本属K抗原可分为82型。肺炎克氏菌大多属3型和12型；臭鼻克氏菌主要属4型，少数为5型或6型；鼻硬结克氏菌一般属3型，但并非所有3型均为该菌。本属细菌在55℃、30分钟内被杀死，在培养基上可存活数周至数月。

2'-脱氧-2-氨基腺苷(dDA)简称2-氨基脱氧腺苷，是精细化工、农药和医药的重要中间体，特别在医药领域，主要用于合成抗艾滋病、抗癌、治疗高血压等方面药物，应用非常广泛。其合成方法主要为化学合成法，采用生物合成从胸苷和2,6-二氨基嘌呤直接转化为2'-脱氧-2-氨基腺苷仍然没有突破性进展。

发明内容

为了克服上述缺陷，本发明工艺采用密西根克雷伯氏菌为菌种，利用该菌株湿菌体为酶源将胸苷和2,6-二氨基嘌呤转化为2'-脱氧-2-氨基腺苷，工艺简单，成本低廉且易操作适合工业化。

本发明技术方案转化过程包括：菌体制备、固定化酶制备、酶促反应和产品提取等四个过程。详细工艺流程如图1所示。

微生物信息：本发明所采用密西根克雷伯氏菌，其拉丁名为以及具体实施方式所使用的密西根克雷伯氏菌(Klebsiella michiganen sis)已经保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号：CGMCC No.16111。

保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏日期为2018年07月16日。

一、菌体制备

1.1菌体活化及产酶培养

菌种：Klebsiellamichiganensis(密西根克雷伯氏菌)

菌株编号：DUR201505001

菌株保藏号：CGMCC16111

活化培养基：酵母膏5g/L、氯化钠10g/L、蛋白胨10g/L、pH7.0

培养条件：38℃、200rpm、12h

产酶培养基：酵母膏75g/L、氯化钠15g/L、玉米浆60mL/L、氯化钙0.8g/L、七水硫酸镁0.6g/L、一水硫酸锰0.8g/L、氯化锌0.1g/L、pH7.0

培养条件：38℃、DO≥50％、14h

1.2菌体收集

产酶培养液离心处理，然后湿菌体用pH 7.0、20mmol/L的磷酸二氢钾缓冲液洗涤，离心所得湿菌体-20℃冷冻保存备用。