[发明专利]一种表达环氧化物水解酶的工程菌及其构建方法和应用

说明书

本发明属于基因工程技术领域的一种表达环氧化物水解酶的工程菌及其构建方法和应用。所述表达环氧化物水解酶的工程菌，其是将环氧化物水解酶基因转入红球菌而得到的。本发明中所构建的工程菌，采用重组红球菌作为宿主菌，相比于重组大肠杆菌，其表达的环氧化物水解酶的酶活、热稳定性、pH稳定性、底物耐受性/产物耐受性都有明显的优势。利用本发明中的工程菌用于催化生产光学纯(R)‑ECH，相比于采用相同游离酶进行的催化，(R)‑ECH的浓度提高了46％，收率提高了31％。相对于游离酶或者重组大肠杆菌，重组红球菌的综合性能优势明显，具有良好的工业应用前景。

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种表达环氧化物水解酶的工程菌及其构建方法和应用。

背景技术

环氧化物水解酶(Epoxide hydrolases)是一类重要的工业酶，可选择性催化水解外消旋环氧化物而得到手性环氧化物和相应的邻位二醇，在医药、农药和香料等方面有广阔的应用前景。环氧化物水解酶广泛存在于细菌、真菌、动物、植物中，其催化过程不需要金属离子或者辅酶参与，具有底物谱宽、催化效率高、对映体选择性高等优点。

手性环氧氯丙烷(ECH)是一种重要的手性合成砌块，在医药、农药、精细化工等领域有广泛的应用，比如，(R)-ECH是合成治疗心绞痛类药物(如美托洛尔、阿普洛尔)的关键手性中间体，(S)-ECH是他汀类药物的起始原料之一。目前已有很多研究者利用环氧化物水解酶拆分制备手性环氧氯丙烷。Choi等利用黑曲霉(Aspergillus niger)在环己烷-水(体积比为98:2)的两相体系中拆分(S)-ECH，底物浓度60mM，ee值大于99％，收率20％(Choi,etal.,1999,J Biosci Bioeng,88:339-341)。Lee等使用毕赤酵母(Pichia pastoris)重组表达来自胶红酵母(Rhodotorula glutinis)的环氧化物水解酶制备(R)-ECH，底物浓度50mM，ee值100％，收率26％(Lee,et al.,2004,Biotechnology and Bioprocess Engineering,9:62-64)。Woo等利用来源于海洋新鞘氨醇杆菌(Novosphingobium aromaticivorans)的环氧化物水解酶制备(S)-ECH，ECH浓度500mM，ee值大于99％，收率20.7％(Woo,et al.,2010,Journal of Bioscience and Bioengineering,110:295-297)。

由于产环氧化物水解酶野生菌的活性、对映体选择性和稳定性等问题，反应的底物浓度或者收率通常较低，在一定程度上限制了环氧化物水解酶的工业应用，因此环氧化物水解酶的重组表达和分子改造受到很多研究者的关注。格罗宁根大学对来自放射形农杆菌(Agrobacterium radiobacter)的环氧化物水解酶进行克隆表达和突变改造，使其对多种底物的对映体选择性大幅提高(EP879890-A1；EP1013768-A1；Van,et al.,2004,CHEMISTRYBIOLOGY,11:981-990)。浙江工业大学将该酶在大肠杆菌中进行克隆表达和定向进化，用于拆分环氧氯丙烷制备(R)-ECH，其活性、对映体选择性和热稳定性均有所提高(Jin,et al.,2013,ENGINEERING IN LIFE SCIENCES,13:385-392；CN105734028A)。虽然环氧化物水解酶已被广泛应用，但为了适应工业催化过程的需求，其稳定性仍有待提高(包括热稳定性、pH稳定性、底物/产物耐受性等)。