[发明专利]一种羊膜间充质干细胞分离培养方法

说明书

本发明提供了一种羊膜间充质干细胞分离方法，属于生物技术领域。所述方法包括：(一)羊膜的预处理；(二)羊膜的初消化；(三)羊膜的再消化；(四)羊膜间充质干细胞的收集；(五)羊膜间充质干细胞的培养。该方法可以获得较多产量的羊膜间充质干细胞，解决很多疾病干细胞来源紧缺和免疫排斥等问题，成为理想的干细胞治疗替代物，在干细胞治疗领域、组织工程与再生医学领域具有广阔的应用前景。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种羊膜间充质干细胞分离培养方法。

背景技术

羊膜通俗地说就是包裹羊水的那层透明薄膜，一张成熟的羊膜面积可达2平方米，聚集了3亿个羊膜细胞。作为胚胎的保护层，羊膜不仅为胎儿发育提供营养，也是一道阻隔母体与胎儿两个异体组织互不排斥的奇妙屏障。

人羊膜来源干细胞包括人羊膜上皮细胞、人羊膜间充质干细胞。近年研究证明，人羊膜间充质干细胞具有与骨髓间充质干细胞相似的表型谱，具有多谱系分化潜能，其有向三胚层细胞分化的潜能：外胚层(神经)、中胚层(骨骼肌、心肌、内皮等)、内胚层(胰腺、肝)，而且其扩增能力强于骨髓间充质干细胞，同时来源广泛。大量的试验研究也证实了人羊膜间充质干细胞比骨髓间充质干细胞有更强的增殖能力及干细胞特性。

目前研究者已经将人羊膜间充质干细胞直接或经定向诱导后移植于各种疾病(骨损伤、糖尿病、肌营养不良、帕金森、神经性、骨髓损伤等疾病)来进行科学研究。人羊膜间充质干细胞推广应用无疑可以解决很多疾病干细胞来源紧缺和免疫排斥等问题，成为理想的干细胞治疗替代物，这不仅为干细胞治疗领域带来希望，更会为组织工程与再生医学领域开辟新的前景。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于一种羊膜间充质干细胞分离培养方法，可高效地分离羊膜间充质干细胞，获得更多的目的细胞，从而为羊膜间充质干细胞移植治疗相关疾病的研究及应用提供足够原料来源。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明的羊膜间充质干细胞分离方法，具体地，依次包括羊膜预处理、初消化、再消化、羊膜间充质干细胞收集和培养的步骤。

本发明的实施方案中，所述羊膜预处理的步骤可以为：在A级洁净度的洁净室内，用无菌缓冲液清洗所述羊膜三次，除尽血迹；然后将所述羊膜的海绵层剥离，剥离过程将残留血液和细小血管去除，最后用无菌缓冲液再清洗一次。在优选的实施方案中，所述羊膜的预处理要在生物安全柜内进行无菌操作；优选的，所述无菌缓冲液包括PBS和生理盐水。

本发明的实施方案中，所述羊膜初消化的步骤可以为：将所述预处理后的羊膜剪碎，置于无菌容器中，加入胰蛋白酶进行消化处理。在优选的实施方案中，所述羊膜初消化的步骤为：向装有羊膜碎块的无菌容器加入所述胰蛋白酶，恒温37℃消化30分钟后去除上清液，然后继续加入所述胰蛋白酶，恒温37℃消化30分钟，加入胰酶终止液进行终止消化。优选的，所述胰酶终止液为不含动物血清终止液。

本发明的优选实施方案中，所述羊膜再消化的步骤可以为：所述羊膜初消化后去除上清，加入胶原蛋白酶，恒温37℃消化60分钟。

本发明的优选实施方案中，所述羊膜间充质干细胞收集的步骤可以为：所述羊膜再消化后获得羊膜组织混悬液，经过100μm的无菌细胞筛网进行过滤，滤液经离心机离心后，收集羊膜间充质干细胞。优选的，所述离心的离心力为500g、离心时间为6分钟。