[发明专利]一种大肠杆菌工程菌高效表达超螺旋质粒DNA的培养方法

权利要求书

1.一种大肠杆菌工程菌高效表达超螺旋质粒DNA的培养方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）液体培养基的配制：

a. 原料称取：

称取相应重量份的甘油21~23份、胰蛋白胨13~15份、酵母提取物13.5~14.5份、氯化钠12.5~13.5份、微量元素0.62~0.68份、改性复合粉8.5~9.5份、无菌水460~540份备用；

b. 培养基的配制：

将操作a称取的无菌水注入搅拌罐内，将搅拌罐内的温度升至99~101℃，然后将操作a中称取的甘油、胰蛋白胨、酵母提取物、氯化钠、微量元素、改性复合粉依次投入搅拌罐内，边搅拌边投入，持续搅拌52~58min，搅拌的同时进行超声波处理；

（2）固体培养基的配制：

将琼脂粉和步骤（1）所得的液体培养基按照质量体积比为7~8g:900~1000mL共同投入搅拌罐内，将搅拌罐内的温度升至98~100℃，边搅拌边加热，直至琼脂粉完全溶解；

（3）培养基灭菌：

将步骤（1）所得的液体培养基和步骤（2）所得的固体培养基分别置于高温高压锅内进行灭菌处理，灭菌的温度为120~122℃，灭菌19~23min后，取出培养基，待培养基的温度降至45~55℃时，分别向灭菌处理后的固体培养基和液体培养基中加入培养基体积比1~2%的氨苄青霉素，摇匀即可；

（4）纯化培养：

将大肠杆菌工程菌以平板划线的方式接种于步骤（3）所得的固体培养基中，将接种后的固体培养基倒平板，然后置于培养箱内进行培养，培养箱内的温度控制为34~36℃，培养直至单菌落的直径为0.7~1.1mm；

（5）扩大培养：

用无菌的接种针挑取步骤（4）中固体培养基中的单菌落接种于步骤（3）所得的液体培养基中，将接种后的液体培养基置于摇床中进行培养，在摇床中培养的同时，每隔30~40min进行一次光波交替处理，直至OD600达到0.9~1.0即可。

2.根据权利要求1所述一种大肠杆菌工程菌高效表达超螺旋质粒DNA的培养方法，其特征在于，所述步骤（1）操作a或操作b中改性复合粉的制备，包括如下步骤：

1）将黄土石和碳酸镧按照重量比为2.2~2.8:1共同投入8.5~9.5%的氢氧化钠溶液中进行浸泡，浸泡时碱液内的温度控制为62~68℃，浸泡处理22~28min后滤出；

2）将步骤1）中滤出的黄土石和碳酸镧混合物投入13.2~13.8%的盐酸溶液中进行浸泡，浸泡时酸液内的温度控制为51~55℃，浸泡处理16.5~17.5min后滤出；

3）将步骤2）中滤出的黄土石和碳酸镧混合物投入煅烧炉中进行煅烧处理，煅烧炉内的温度控制为930~970℃，煅烧处理5~7min后，将煅烧炉中的温度降至102~104℃，然后取出混合物立马投入改性液中进行浸泡，浸泡过程在微波炉中进行，浸泡处理13~17min后，过滤得滤渣；

4）将步骤3）中所得的滤渣置于烘箱内进行干燥，烘箱内的温度控制为66~74℃，干燥至含水率为6.5~7.5%即得改性复合粉。

3.根据权利要求2所述一种大肠杆菌工程菌高效表达超螺旋质粒DNA的培养方法，其特征在于，所述步骤3）中改性液各成分及其对应重量份为：十二烷基苯磺酸钠12.2~12.8份、硬脂酸钙8.5~9.5份、水解酪蛋白6.5~7.5份、异戊醇7.5~8.5份、无菌水305~315份。

4.根据权利要求2所述一种大肠杆菌工程菌高效表达超螺旋质粒DNA的培养方法，其特征在于，所述步骤3）中微波炉中的频率控制为88~90GHz。

5.根据权利要求1所述一种大肠杆菌工程菌高效表达超螺旋质粒DNA的培养方法，其特征在于，所述步骤（1）操作a或操作b中微量元素各成分及对应重量份为：硫酸铜0.0022~0.0028份、硫酸锰0.00013~0.00015份、碘化钾0.00235~0.00245份、硫酸锰0.000012~0.000018份、氯化钴0.000135~0.000145份、硫酸锌0.0022~0.0028份。