[发明专利]LDH-dsRNA纳米化制剂及其制备方法和应用

说明书

本发明公开了一种LDH‑dsRNA纳米化制剂及其制备方法和应用，LDH‑dsRNA纳米化制剂包括层状双氢氧化物和dsRNA，TMV dsRNA吸附在层状双氢氧化物表面，dsRNA的靶标基因为TMV外壳蛋白CP基因。LDH‑dsRNA纳米化制剂制备方法包括：抽提基因组RNA、设计引物、RT‑PCR扩增、dsRNA合成、dsRNA与层状双氢氧化物结合得到LDH‑dsRNA纳米化制剂。本发明的LDH‑dsRNA纳米化制剂具有持效时间长、环境友好型、对作物无药害等优点，可应用于预防和治疗TMV。

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及一种LDH-dsRNA纳米化制剂及其制备方法和应用。

背景技术

LDH(layered double hydroxide，LDH)材料是由于在盐水体中沉淀或通过玄武岩的侵蚀而自然产生的一种天然的无机层状阴离子粘土材料，因其二维板层结构稳定，组装性强，安全性高，拥有良好的生物相容性、热稳定性以及机械性能，作为药物载体材料、电极材料、吸附材料等被广泛研究。

RNAi(RNA interference)现象在生物中普遍存在，是一种由小干扰RNA(smallinterfering RNA，siRNA)介导在转录后产生基因沉默的现象，具有特异性、高效性、可传播性、竞争效应和位置效应等特点，在调控基因表达、抵御病毒入侵和防止基因组中逆转座元件扩增等方面均起到重要作用。RNAi技术在植物中的表现是将病毒的病原dsRNA转入植株的叶片或叶脉等部位，使得病原dsRNA与其同源mRNA发生基因沉默，使其降解的过程。随着对RNA干扰技术及其相关机制的不断研究，运用RNA干扰技术的特点更为高效性、特异性和可传播性地防治植物病毒病已有了一定的研究和应用，且运用RNAi为防治植物病毒的提供了一个新途径。目前应用dsRNA抵抗病毒的稳定性与系统性欠佳，如何增强dsRNA的稳定性能使得RNAi是本领域急需解决的问题。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种LDH-dsRNA纳米化制剂，该LDH-dsRNA纳米化制剂稳定性提高，对环境友好，其制备方法简单，可应用于对TMV的预防和治疗。

一种LDH-dsRNA纳米化制剂，所述LDH-dsRNA纳米化制剂包括层状双氢氧化物和dsRNA，所述dsRNA吸附在所述层状双氢氧化物表面；所述dsRNA的靶标基因为TMV外壳蛋白CP基因。

上述的LDH-dsRNA纳米化制剂，优选的，所述层状双氢氧化物和dsRNA的质量比为1︰10～100。进一步的，所述层状双氢氧化物和dsRNA的质量比为1︰10。

做为一个总的技术构思，本发明还提供了一种上述的LDH-dsRNA纳米化制剂的制备方法，包括以下步骤：

S1、以TMV RNA为模板；根据所述TMV RNA设计含有Hind III和Kpn I的扩增引物，进行RT-PCR扩增得到扩增产物；

S2、将所述扩增产物连接转化至感受态细胞中，得到重组子；

S3、以所述重组子作为模板，设计含有T7启动子序列的引物，进行PCR扩增，得到含有T7启动子的扩增产物；

S4、将含有T7启动子的扩增产物作为模板，进行dsRNA的体外合成；

S5、将合成的所述dsRNA与层状双氢氧化物进行结合即得到LDH-dsRNA纳米化制剂。

上述的制备方法，优选的，所述S1步骤中所述含有Hind III和Kpn I的扩增引物为SEQ ID NO.2所示的DNA序列和SEQ ID NO.3所示的DNA序列。

上述的制备方法，优选的，所述S2步骤具体为：将所述扩增产物连接至pEASY-T1载体上得到连接产物，将所述连接产物转化至感受态细胞中得到重组子。