[发明专利]基于类器官方法的患者来源的肝癌正常免疫小鼠移植瘤模型的构建方法及其应用

说明书

基于类器官方法的患者来源的肝癌正常免疫小鼠移植瘤模型的构建方法及其应用，它属于医药领域，本发明的目的是以“类器官”培养技术，采用微载体为支架材料，复合患者来源的肝癌细胞培养出细胞‑3D材料复合体，然后直接将细胞‑3D材料复合体接种于正常免疫小鼠皮下，构建体内患者来源的肝癌移植瘤模型，解决目前人肝癌移植瘤模型存在的采用裸鼠、SCID鼠等免疫缺陷小鼠，不易饲养，价格昂贵，成瘤率不高的问题；尤其是解决免疫缺陷小鼠人肝癌移植瘤模型无法反映机体免疫系统在肿瘤发生、发展过程中所起的重要作用的问题，及免疫缺陷小鼠人移植瘤模型存在成瘤周期长，临床急迫需要药物治疗患者的药敏需求。本发明应用于小鼠模型构建领域。

技术领域

本发明属于医药领域，具体地涉及一种医学肿瘤动物模型—基于“类器官”构建的患者来源的正常免疫小鼠肝癌移植瘤模型及建立该模型的方法，以及它们在医药领域和临床中的应用。

背景技术

肿瘤是一类严重威胁人类健康的多发病和常见病，其发病机制尚未完全阐明。肝癌是最常见的恶性肿瘤之一，死亡率高居全球前三位。术后5年生存率约10％-20％。治疗效果不尽人意，预后差。因此建立能够模拟临床特征的肝癌动物模型对于肝癌的研究意义重大。

新进研究成果类器官(organoids)被评为2017年生命科学领域最有潜力的“年度技术”，类器官是一种微型的三维细胞培养模型，源自患者原发性肿瘤，并在实验室中进行培养。从类器官形成之初、到进行药物治疗之后，这些类器官在组织学、分子水平和功能上能够持续与来源肿瘤组织保持高度一致，很好地反映其特点。

长期以来，人类肿瘤细胞系和移植瘤裸鼠动物模型一直作为肿瘤研究和抗癌新药的研发平台，然而，由于细胞系所形成的肿瘤缺少间质细胞，而间质细胞在肿瘤的发生、发展和转移过程中发挥着重要作用，给肿瘤的基础研究和有效抗癌新药的研发造成极大困难，同时，上述肿瘤模型很难准确模拟临床患者的真实病情，难以满足临床前实验的需要。

近年，国外学者将患者的新鲜肿瘤手术标本移植到免疫缺陷小鼠，建立了新的模型，命名为肿瘤患者来源的移植瘤(patient-derived xenografts，PDXs)。这些模型成功地再现了患者肿瘤的分子生物学、组织学和病理学特点，但因裸鼠缺乏T细胞，SCID鼠同时缺乏T细胞和B细胞，它们存在免疫功能缺陷，难以阐明肿瘤发生、发展和转移与机体免疫的关系，更不适合研究肿瘤免疫治疗，也不是开发新型抗肿瘤药物的最理想模型。患者来源的正常免疫功能小鼠移植肿瘤模型，弥补了因免疫缺陷小鼠缺乏免疫细胞而不能准确模拟机体免疫系统对肿瘤的免疫攻击等重要缺点，从而更准确地还原患者肿瘤组织的分子生物学特点及肿瘤微环境，为研究肿瘤的发病机制和新药研发以及临床精准治疗打下良好基础。但是目前还没有相关的异种肿瘤正常免疫功能小鼠移植瘤模型。

发明内容

本发明的目的是以“类器官”培养技术，采用微载体(NMC2)为支架材料，复合患者来源的肝癌细胞培养出细胞-3D材料复合体，然后直接将细胞-3D材料复合体接种于正常免疫小鼠皮下，构建体内患者来源的肝癌移植瘤模型，从而解决目前人肝癌移植瘤模型存在的采用裸鼠、SCID鼠等免疫缺陷小鼠，不易饲养，价格昂贵，成瘤率不高的问题；尤其是解决了免疫缺陷小鼠人肝癌移植瘤模型无法反映机体免疫系统在肿瘤发生、发展过程中所起的重要作用的问题，以及免疫缺陷小鼠人移植瘤模型存在成瘤周期长(一般需要3-5个月)，难以解决临床急迫需要药物治疗患者的药敏需求。

本发明的基于类器官方法的患者来源的肝癌正常免疫小鼠移植瘤模型的构建方法，它是按照以下步骤进行的：

一、获取人肝癌肿瘤细胞：取肝癌细胞和肝癌组织间质细胞，以含10％胎牛血清的DMEM、质量百分含量为1％青霉素和质量百分含量为1％链霉素的完全培养液将上述细胞混匀；若台盼蓝计数活细胞数>95％，则调整细胞浓度至2×10⁷/mL，然后放入37℃、5％CO²培养箱；