[发明专利]远志齐墩果酸合酶基因PtOAS及其应用

说明书

本发明公开了一种远志齐墩果酸合酶基因PtOAS及其应用，具体公开了远志齐墩果酸合酶基因PtOAS及含所述基因PtOAS的酵母表达载体的构建，同时还公开了所述基因PtOAS及含所述基因PtOAS的酿酒酵母表达载体在制备齐墩果酸中的应用。本发明为远志中齐墩果酸合酶基因的功能验证提供理论依据，同时为通过酿酒酵母制备齐墩果酸提供实践基础。

技术领域

本发明属于生物基因工程技术领域，尤其涉及齐墩果酸相关基因-远志齐墩果酸合酶基因PtOAS及其在制备齐墩果酸中的应用。

背景技术

远志(Polygala tenuifolia Willd.)，是我国重要的大宗药材之一。2015年版《中国药典》记载远志具有安神益智、交通心肾、祛痰、消肿之功效。植物次生代谢物是中药发挥药效的物质基础，而皂苷类成分则是远志发挥益智等传统功效和抗衰老及脑保护等现代药理作用的主要贡献者。远志皂苷，属齐墩果烷型的五环三萜类化合物，以原远志皂苷元为主要母核，结构复杂且较为相似，采用传统化学方法制备目前面临着诸多困难，而通过植物组培方式生产则相关研究又进展缓慢，导致至今仍处于无法大量获得此类化合物的窘况，进一步限制了远志益智、抗衰老及脑保护等作用与机制的深入研究。这一现状已严重制约了远志的先导化合物发现和新适应症寻找等新药研发进程。

而在体外进行天然产物的异源合成为远志皂苷的开发提供了新的思路，即通过研究远志皂苷合成途径中的催化酶，将合成途径导入微生物细胞，从而大量获得天然产物或其前体。远志皂苷的生物合成分为三个阶段：(1)以乙酰辅酶A为原料，通过MVA、途径合成前体IPP和DMAPP；(2)前体物质经过酶的催化合成骨架2，3-氧化角鲨烯；(3)细胞色素CYP450对骨架加氧及糖基转移酶UGT的加糖促进皂苷的合成。在这一过程中，研究参与远志皂苷生物合成途径中的关键酶显得至关重要。其中前两个阶段的合成过程已经基本明确。Jin等在远志中发现了β-AS(β-香树脂醇合酶)，可催化2，3-氧化角鲨烯生成β-香树脂醇。张根林在酿酒酵母中构建了β-香树脂醇合成途径，并对途径及发酵条件进行优化，优化后酿酒酵母中β-香树脂醇的产量为156.7mg/L。Dai等构建了产人参皂苷苷元的酵母工程菌，其中引入的苜蓿齐墩果酸合酶(MtOAS)可催化β-香树脂醇生成齐墩果酸。

前期研究结果发现，PtOAS可能以β-香树脂醇为底物，催化其生成远志皂苷的苷元齐墩果酸。因此，本发明通过在远志中克隆得到基因PtOAS，经序列比对发现PtOAS与其他物种中的类似基因相比同源性在75％左右，因此，PtOAS可能发挥氧化β-香树脂醇C-28位，即合成齐墩果酸的作用。

发明内容

本发明的目的在于提供一种远志中齐墩果酸相关基因-齐墩果酸合酶基因及其在制备齐墩果酸中的应用。

本发明提供了一种远志齐墩果酸合酶基因PtOAS，所述基因PtOAS的cDNA序列如SEQ ID No.1所示。

本发明还提供了一种含有上述远志齐墩果酸合酶基因PtOAS的酿酒酵母表达载体，所述载体克隆区域核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。

产齐墩果酸酿酒酵母的构建方法：从远志中克隆得到齐墩果酸合酶基因PtOAS，使用重叠延伸PCR技术构建基因元件，使用酶切连接的方式构建质粒pRS304-ADH1p-PtOAS-ADH1t-ALA1p-CPR-ALA1t，经测序验证后，将此质粒以醋酸锂转化的方式转入产β-香树脂醇的酿酒酵母中，经酵母代谢物检测得到产齐墩果酸的酿酒酵母菌株。

本发明所述远志齐墩果酸合酶基因PtOAS可用于在酿酒酵母中制备齐墩果酸。

实验证实：将远志齐墩果酸合酶基因PtOAS转入酿酒酵母，经代谢物检测齐墩果酸的产量为0.28mg/L。