[发明专利]一种复合微生物制品高效表达的方法及其用途

说明书

本发明公开了一种复合微生物制品高效表达的方法，其制备方法包括以下步骤：S1、纳豆制作：取适量纳豆杆菌菌种液体振荡培养，然后放入冰箱冷藏备用，选取颗粒饱满、蛋白质含量高的大豆，用大豆5倍的水量浸泡二十四小时（室温18度），沥水，然后加入5%的食盐和2%蔗糖，于高压锅内（121度）蒸煮30‑45分钟，冷却至50度以下。该复合微生物制品高效表达的方法及其用途，运用微生物发酵工程技术构建高效表达质粒，优化工程菌发酵条件实现纳豆激酶的低成本、高活性、高产量生产，该纳豆激酶粉末的酶活力为400万U/g‑600万U/g，1克大豆可发酵出纳豆激酶2000IU，较市面上传统的生产方法，产量可提高40%‑50%。

技术领域

本发明涉及生物医药、生物发酵工程技术领域，具体为一种复合微生物制品高效表达的方法及其用途。

背景技术

纳豆是一种在日本广受欢迎的具有1000多年历史的传统营养食品，我国称之为“腊八豆”。与源于我国历史更悠久的真菌发酵食品豆豉有所不同，纳豆是由一种细菌枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的变种纳豆菌(Bacillus subtilis (natto))发酵煮熟的大豆而制成的。据说长期食用纳豆可以预防和治疗心血管疾病。

1986年日本的须见洋行博士发现纳豆及其提取物在体外具有溶解血栓的作用。后来研究发现纳豆在发酵过程中会产生一种丝氨酸蛋白酶，这种酶能够有效的溶解血栓，模仿尿激酶（Urokinase）将其命名为纳豆激酶（Nattokinase）。这是一种胞外丝氨酸蛋白酶（extracellular serine protease），由aprE（纳豆菌中称aprN)基因编码。

由于我国心脑血管发病率日益增高，心脑血管疾病的防治受到越来越多的关注。纳豆作为一种保健食品也更多地受到人们的喜爱，纳豆激酶显著的溶解血栓作用在医药研究及临床应用方面也受到广泛重视，市场上有已经一些日本进口和国内的纳豆激酶保健品。每克湿纳豆含有相当于目前临床使用的溶栓制剂（尿激酶）1600IU，纳豆激酶作为一种溶栓制剂具有很好的应用前景。

近年纳豆激酶作为功能性食品、食品添加剂和普通食品发展十分迅速。由于纳豆激酶具有目前正在使用的一些溶栓剂所无法比拟的优点，人们很渴望能将其开发为新一代溶栓剂。但是，从目前状况来看，纳豆激酶产量不高，纯度比较低，制成制剂后活性不高，以及活性稳定性差，免疫原性高。因而，要将其开发为实用的新型溶栓剂，提高其产量、纯度，保持高的稳定的纤溶活性，是急需解决的问题。

发明内容

（一）解决的技术问题

针对现有技术的不足，本发明提供了一种复合微生物制品高效表达的方法及其用途，解决了现有纳豆激酶产量低、活性低的问题。

（二）技术方案

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种复合微生物制品高效表达的方法，其制备方法包括以下步骤：

S1、纳豆制作：取适量纳豆杆菌菌种液体振荡培养，然后放入冰箱冷藏备用，选取颗粒饱满、蛋白质含量高的大豆，用大豆5倍的水量浸泡二十四小时（室温18度），沥水，然后加入5%的食盐和2%蔗糖，于高压锅内（121度）蒸煮30-45分钟，冷却至50度以下，造无菌环境下，将事先培养好的纳豆杆菌菌种液体喷射于大豆中，拌匀，恒温培养发酵二十四小时，得纳豆，将纳豆放入4度冰箱中老化20小时，备用；

S2、纳豆激酶制作：种子液培养，种子液配方为2%-3%葡萄糖、0.3%-0.4%磷酸氢钠、0.04%-0.05%硫酸镁、2%-3%酵母粉、3%-5%魔芋粉以及0.03%-0.04%氯化钙，种子液的PH值为7，以200转每分钟的速度振荡5小时，按8%的量接种于上述制得的纳豆中，于35-37度环境下，发酵24小时，然后用生理盐水浸泡提取、离心，既得纳豆激酶试液；