[发明专利]一种具有冷适应特性的褐藻胶裂解酶AlgA1及其应用

说明书

本发明涉及一种具有冷适应特性（Cold‑adapted）的褐藻胶裂解酶及其应用。所述褐藻胶裂解酶AlgA1为一种人工设计的新型褐藻胶裂解酶，其N端为褐藻胶裂解酶的保守催化功能域（Gly¹‑His²⁴⁵），在其C端设计了一段包含有160个氨基酸的碳水化合物结合结构域区（Arg²⁴⁶‑Pro⁴⁰⁵），其氨基酸序列与已有的褐藻胶裂解酶序列相似度（Identity）最高为89%。本发明所述的褐藻胶裂解酶AlgA1具有冷适应特性，酶促反应可控制在低温下进行，节省能源。该酶作用方式为内切，降解主产物为不饱和褐藻胶二、三糖。本发明所述的褐藻胶裂解酶性质稳定，产量大，具有一定的工业化应用潜质。

技术领域

本发明涉及一种具有冷适应特性的褐藻胶裂解酶AlgA1及其应用，属于生物技术领域。

背景技术

褐藻胶是褐藻细胞壁的重要成分，由互为差向异构体的α-L-甘露糖醛酸（Mannuronic acid，M）和β-D-古罗糖醛酸（Guluronic acid，G）通过1,4糖苷键连接而成的线性多糖。通常，褐藻胶由海带、马尾藻、巨藻等大型褐藻加工制成。我国是海藻养殖大国，褐藻胶产量占到世界总产量的70%以上。褐藻胶广泛应用在化工、医药、食品等行业。不同聚合度的褐藻胶寡糖具有不同的生物学活性。最新研究表明，利用褐藻胶制备的聚M段寡糖药物GV-971能多靶点的抑制β淀粉样细胞的聚集和细胞毒性，已完成三期临床实验；聚G寡糖能够与抗生素联合使用抑制多种临床多耐药致病菌。对比传统的酸碱法降解褐藻胶，酶法降解褐藻胶具有条件温和、易控制、绿色环保等优势。

褐藻胶裂解酶通过β-消除反应催化褐藻胶分子内1,4糖苷键的断裂，产生非还原性末端具有共轭双键的不饱和寡糖。传统的褐藻胶裂解酶是从海洋动物消化道或海洋细菌的发酵液上清中直接分离提取，受限于天然褐藻胶裂解酶产量低，发展基因工程的褐藻胶裂解酶势在必行。目前在多糖降解酶数据（http://www. cazy.org/）中，已有几百个预测的褐藻胶裂解酶基因，其中部分基因在大肠杆菌或酵母菌中进行了重组表达，并研究了其酶学性质。但是大多数报道的褐藻胶裂解酶在低温下活性很低，必须加热到一定程度（40-50℃）才能发挥作用，极大增加了工业化应用过程中的能量消耗，因此，寻找具有在低温下可以发挥作用的具有冷适应特性的褐藻胶裂解酶并研究其降解条件及最终产物具有重要意义。

发明内容

本发明针对现有技术的不足，提供了一种具有冷适应（Cold-adapted）特性的褐藻胶裂解酶及其应用。该酶与已有褐藻胶裂解酶的氨基酸相似度仅为89%。其N端为催化区，C端含有一段由160个氨基酸组成的碳水化合物结合域，该区域可显著增强其冷适应的特性。该酶的最适反应温度为30℃；在15℃和10 ℃下反应活性可占到最高反应温度下活性的79.1%和62.6%。该酶降解方式为内切，降解主产物为褐藻胶不饱和二糖和三糖。

一方面，本发明提供一种具有冷适应特性的褐藻胶裂解酶AlgA1，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示。

SEQ ID NO.1：

GALASEAPAAPDAECEYPADVLDLKNWKETLPTGSAGKPKEVKQPALATFSADPWFVALPGCDGVRFRAAANCVTTSGSSYPRSELREMTNNGKDNAGWSSWGEFQVFGTGTKLMYSTRAGAVTKLPNDPPHVVAAQIHNGSDDVSVFRIEGNKAYVTNGDNSFYHLVTSDYQSGRKFVARFEVSGGKIKAYFDGKLQTTIGKSFSGGYFKTGAYVQANCSKSSPCSSSNYGEVHVFRVGETHGHRGRIALSAALAAALGATVLSAASSASAADAPISQGKPATASSVESAAFPASAAVDGDAGTRWSSTFADPQWLQVDLGSTQSISQVVLNWEAAYASAFTIQTSANGSTWTTISPVTAGKAGVQTLTVTGSGRYVRMSGTTRATPYGYSLWEFQVFGTGTTP