[发明专利]一种具有热恢复特性内切型褐藻胶裂解酶及其应用

说明书

本发明涉及一种具有热恢复特性的内切型褐藻胶裂解酶及其应用。所述褐藻胶裂解酶为一种新型褐藻胶裂解酶AlyV11，氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明提供的褐藻胶裂解酶N端含有一段铰链区（Met¹‑Thr¹²），其氨基酸序列与已知功能的褐藻胶裂解酶序列相似度仅为79%。本发明所述的褐藻胶裂解酶AlyV11具有热恢复特性，在煮沸5分钟后，放置在30℃孵育10分钟，可恢复其61.5%的活性。该酶作用方式为内切，降解主产物为不饱和褐藻胶二、三糖。本发明所述的褐藻胶裂解酶产量大，性质新颖，具有一定的工业化应用潜质。

技术领域

本发明涉及一种具有热恢复特性的内切型褐藻胶裂解酶及其应用，属于生物技术领域。

背景技术

褐藻胶是褐藻细胞壁的重要成分，由互为差向异构体的α-L-甘露糖醛酸（Mannuronic acid，M）和β-D-古罗糖醛酸（Guluronic acid，G）通过1,4糖苷键连接而成的线性多糖。通常，褐藻胶由海带、马尾藻、巨藻等大型褐藻加工制成。我国是海藻养殖大国，褐藻胶产量占到世界总产量的70%以上。褐藻胶广泛应用在化工、医药、食品等行业。不同聚合度的褐藻胶寡糖具有不同的生物学活性。最新研究表明，利用褐藻胶制备的聚M段寡糖药物GV-971能多靶点的抑制β淀粉样细胞的聚集和细胞毒性，已完成三期临床实验；聚G寡糖能够与抗生素联合使用抑制多种临床多耐药致病菌。对比传统的酸碱法降解褐藻胶，酶法降解褐藻胶具有条件温和、易控制、绿色环保等优势。因此，寻找具有特殊性质的褐藻胶裂解酶，并研究其降解条件及最终产物具有重要意义。

褐藻胶裂解酶通过β-消除反应催化褐藻胶分子内1,4糖苷键的断裂，产生非还原性末端具有共轭双键的不饱和寡糖。传统的褐藻胶裂解酶是从海洋动物消化道或海洋细菌的发酵液上清中直接分离提取，受限于天然褐藻胶裂解酶产量低，发展基因工程的褐藻胶裂解酶势在必行。

目前在多糖降解酶数据库中（http://www.cazy.org/）已有几百个预测的褐藻胶裂解酶基因，其中部分基因在大肠杆菌或酵母菌中进行了重组表达，并研究了其酶学性质。但是大多数报道的褐藻胶裂解酶热稳定和热恢复性较差，容易失活，无法达到工业化应用的要求。

发明内容

本发明针对现有技术的不足，提供了一种具有热恢复特性的褐藻胶裂解酶及其应用。该酶与已有褐藻胶裂解酶的氨基酸序列相似度仅为79%。其N端含有一段由12个氨基酸组成的铰链区，该区域可显著增强其热恢复的特性。该酶的最适反应温度为30℃，最适反应pH为7.6；酶液煮沸5分钟后，放置在30℃孵育10分钟，可恢复其61.5%的活性。该酶降解方式为内切，降解主产物为褐藻胶不饱和二糖和三糖。

一方面，本发明提供一种具有热恢复特性的褐藻胶裂解酶AlyV11，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示。

SEQ ID NO.1：

MLLTPCSYSATDTHQNTLPASHSTVLALGSALVDNSSLAETLATTHILPESHQALPQGELLGDFNSLDEIEENTLIPKSHTSLAEGVLLWYQKKEYELPGEKALSDSFALKPLFYTSTDGGMVFACPNAGAKTSKNTKYARTELREMLRRGNTTIKTKGITENNWVLNSAHGSVKRKAGAVEGSLEATLAVNRVSTTGDEEKVGRVIIGQITATDEEPIRLYYRKLPGNDNGSIYFAHEINGGDDVWVKMVGKVTLSDNTLTKVGHGKRNKSYKITVNKNILFVTLYMEGKQNATKSFDMSKSGYNKNNQYMYFKNAGVYNQNNSGSDKEGVQATFYH。

另一方面，本发明还提供一种具有热恢复特性的褐藻胶裂解酶AlyV11对应的核酸序列，如SEQ ID NO.2所示。

SEQ ID NO.2：