[发明专利]一种二甲戊灵半抗原与抗原的制备方法及应用

权利要求书

1.一种二甲戊灵半抗原的制备方法，其特征在于：是由N-(1-乙基丙基)-3,4-二甲基苯胺与4-溴丁酸乙酯反应生成烃基化N-(1-乙基丙基)-3,4-二甲基苯胺，再与浓硝酸反应生成硝基烃化N-(1-乙基丙基)-3,4-二甲基苯胺，然后与氢氧化钾反应得到，其分子结构式为：

所述烃基化N-(1-乙基丙基)-3,4-二甲基苯胺的分子结构式为

所述硝基烃化N-(1-乙基丙基)-3,4-二甲基苯胺的分子结构式为

。

2.如权利要求1所述的二甲戊灵半抗原的制备方法，其特征在于：该制备方法的具体步骤如下：

1）取1.00 g N-(1-乙基丙基)-3,4-二甲基苯胺，加80 mL丙酮溶解，加0.35 g 氢氧化钾，加1.21 g 4-溴丁酸乙酯，加热回流反应3 h，TLC检测，原料全部反应完成，停止反应，冷却到室温，旋蒸，除去丙酮，加60 mL水，加50 mL二氯甲烷萃取，有机相无水硫酸钠干燥，蒸干浓缩，上硅胶柱，使用体积比为10:1的石油醚/乙酸乙酯洗脱分离，得到中间体烃基化N-(1-乙基丙基)-3,4-二甲基苯胺1.51 g；

2）取1.50 g中间体烃基化N-(1-乙基丙基)-3,4-二甲基苯胺，加5 mL浓硫酸溶解澄清，在冰浴下缓慢滴加浓硝酸3 mL，恢复至室温，继续搅拌4 h，停止反应，冰浴下加蒸馏水30mL，加氢氧化钠溶液调节pH值到7，加50 mL乙酸乙酯萃取，无水硫酸钠干燥蒸干，得到红色油状物，使用体积比为1:5的二氯甲烷/正己烷重结晶，得到硝基烃化N-(1-乙基丙基)-3,4-二甲基苯胺1.81 g；

3）取1.80 g硝基烃化N-(1-乙基丙基)-3,4-二甲基苯胺加2 mol/L氢氧化钾水溶液，60℃搅拌3 h，TLC检测，原料无剩余，停止反应，冷却到室温，加稀盐酸，调节pH值到6，加80 mL乙酸乙酯萃取，有机相水洗，无水硫酸钠干燥，蒸干，使用体积比为1:1的乙醚/正己烷重结晶，得到二甲戊灵半抗原产物1.60 g。

3.如权利要求1所述方法制备的二甲戊灵半抗原的应用，其特征在于：所述二甲戊灵半抗原可用于制作动物免疫的抗原体系原料。

4.一种二甲戊灵抗原的制备方法，其特征在于：是由权利要求1制备得到的二甲戊灵半抗原与载体蛋白偶联得到，所述载体蛋白为牛血清白蛋白、鼠血清蛋白、兔血清蛋白、甲状腺蛋白、卵清蛋白、血蓝蛋白或人血清白蛋白。

5.如权利要求4所述的二甲戊灵抗原的制备方法，其特征在于：具体步骤如下：取二甲戊灵半抗原10 mg，加二甲基亚砜（DMSO）溶解，加碳二亚胺（EDC）5.7 mg，搅拌，澄清，加N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）3.8 mg，室温搅拌活化3 h，得到A液；取人血清白蛋白50 mg，加8 mL0.1 mol/L磷酸盐缓冲液（PB）溶解，得到B液，将A液缓慢滴加到B液中，室温搅拌反应5 h；停止反应，0.02 M磷酸盐缓冲液（PBS）透析3天，每天换液3次，得二甲戊灵抗原；分装，-20℃保存。

6.如权利要求4所述的二甲戊灵抗原的制备方法，其特征在于：具体步骤如下：取二甲戊灵半抗原6 mg，加0.2 mL 二甲基甲酰胺（DMF）溶解，澄清，加三乙胺20 μL，搅拌5 min，加氯甲酸异丁酯6 μL，搅拌2 h，得到半抗原活化液A液；取卵清蛋白50 mg，加8 mL 0.05 mol/L pH 7.2 PB缓冲液溶解，得到B液，将A液缓慢滴加到B液中，室温搅拌反应5 h；停止反应，0.02 M PBS缓冲液透析3天，每天换液3次，得二甲戊灵抗原；分装，-20℃保存。

7.如权利要求4所述方法制备的二甲戊灵抗原的应用，其特征在于：采用所制备的二甲戊灵抗原免疫动物得到的单克隆抗体，可用于建立酶联免疫吸附测定方法和胶体金试纸快速测定法，从而实现烟草及食品中二甲戊灵的快速检测。