[发明专利]一种利用放线菌提升植物炭疽菌拮抗作用的方法

权利要求书

1.一种利用放线菌提升植物炭疽菌拮抗作用的方法，其特征在于，包括以下步骤：

A：采集：取一定量的太子参叶斑病病叶和茶炭疽病病叶，以及一定量从太子参及茶叶主产区采集的土壤；

B：分离：首先从太子参叶斑病病叶和茶炭疽病病叶分离出炭疽病原菌，然后从太子参及茶叶主产区采集的土壤样品中分离出多株细菌；

C：筛选：从多株细菌中筛选出多株具有拮抗炭疽病原菌的细菌菌株，然后通过平板划线法在培养基中将菌株纯化，对纯化后的细菌菌株进行复筛，并在同一个培养皿中做3-5次重复，得到复筛后的细菌菌株；

D：复筛：通过扩增细菌的16-SrDNA序列，将测序回来的序列经NCBI同源比对后，构建系统进化树，然后将细菌经过革兰氏染色和芽孢染色，再通过全自动微生物分析系统对多种细菌进行生理生化指标测定，将其分为不同的种属，然后通过压片镜检法来筛选出放线菌；

E：统计：将含有炭疽病原菌菌落分别放入不同的培养基中(含不同种类的放线菌菌株)，培养4-6小时后，统计多种细菌菌株对炭疽病原菌的菌丝生长抑制率，得到拮抗效果最好的放线菌菌株，将其命名为菌株A 1103；

F：制备：首先将菌株A 1103放入培养基中活化，时间为2-4天，然后将活化后的菌株A1103接种到高氏一号液体发酵培养基，取发酵液经由无菌滤纸抽滤，分别获得上清液和菌丝体，取上清液，用乙酸乙酯萃取1-3次，合并萃取液，得上清液的乙酸乙酯萃取液，菌丝体用60-80％的丙酮水溶液浸泡，浸泡时间为8-12小时，然后用超声波破碎提取2-4次，合并提取液，将提取液减压浓缩至无丙酮后，得到菌株A 1103的粗提取液，

G：注射：将所得粗提物以无菌水稀释配制成溶液，注入植物的体内。

2.根据权利要求1所述的一种利用放线菌提升植物炭疽菌拮抗作用的方法，其特征在于：所述步骤B中炭疽病原菌和细菌的分离方法均为土壤稀释分离法。

3.根据权利要求1所述的一种利用放线菌提升植物炭疽菌拮抗作用的方法，其特征在于：所述步骤C中筛选的方法为平板对峙法。

4.根据权利要求1所述的一种利用放线菌提升植物炭疽菌拮抗作用的方法，其特征在于：所述步骤C中的培养基为高氏合成1号固体培养基，不含琼脂。

5.根据权利要求1所述的一种利用放线菌提升植物炭疽菌拮抗作用的方法，其特征在于：所述步骤C中的培养时间为6-8天，培养温度为26-30℃。

6.根据权利要求1所述的一种利用放线菌提升植物炭疽菌拮抗作用的方法，其特征在于：所述步骤D中全自动微生物分析系统的型号为VITEK 2 COMPACT型全自动微生物鉴定系统。

7.根据权利要求1所述的一种利用放线菌提升植物炭疽菌拮抗作用的方法，其特征在于：所述步骤E中的培养基为加热熔化的液体PDA培养基，培养条件为25-27℃。

8.根据权利要求1所述的一种利用放线菌提升植物炭疽菌拮抗作用的方法，其特征在于：所述步骤E中采用十字交叉测量菌落直径，计算菌落直径平均值和菌丝生长抑制率，菌丝生长抑制率计算公式如下：

菌丝生长抑制率(％)＝[1-(处理菌落直径-菌饼直径)/(对照菌落直径-菌饼直径)]×100。

9.根据权利要求1所述的一种利用放线菌提升植物炭疽菌拮抗作用的方法，其特征在于：所述步骤F中的培养基为PDA斜面培养基，培养条件为28-30℃恒温培养箱。

10.根据权利要求1所述的一种利用放线菌提升植物炭疽菌拮抗作用的方法，其特征在于：所述步骤G中溶液的浓度为200-600mg/L。