[发明专利]稀有突变检测方法、其试剂盒及应用

权利要求书

1.一种稀有突变检测方法，其特征在于，所述方法为U-ARMS方法，包括以下步骤：

(1)根据目的基因突变位点设计ARMS引物，所述ARMS引物的上游引物或下游引物的3′末端为突变位点，进行LNA修饰，并在突变位点识别引物的5′末端延伸一段通用序列；

(2)根据所述通用序列设计Taqman-MGB探针，所述Taqman-MGB探针特异识别扩增产物的反义链，所述探针的5′末端标记荧光基团，所述探针的3′末端结合有小沟结合分子；

(3)根据所述通用序列设计通用引物；

(4)提取模板DNA，利用步骤(1)所得ARMS引物、步骤(2)所得Taqman-MGB探针和步骤(3)所得通用引物对模板DNA进行荧光PCR检测。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中，所述突变位点为EGFR基因2369位错义突变，所述ARMS引物为SEQ ID No:2和SEQ ID No:6所示的核苷酸序列。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中，所述Taqman-MGB探针为SEQ ID No:7所示的核苷酸序列。

4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)中，所述通用引物为SEQ ID No:8所示的核苷酸序列。

5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其特征在于，所述步骤(4)中，所述通用引物与ARMS引物中的突变识别引物加入比例为10～100:1，优选为30～50:1，最优选为40:1。

6.一种稀有突变检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括检测目的基因的突变位点的ARMS引物、通用引物和Taqman-MGB探针；

其中，所述ARMS引物的上游引物或下游引物的3′末端为突变位点，进行LNA修饰，并在突变位点识别引物的5′末端延伸一段通用序列；

所述Taqman-MGB探针特异识别扩增产物的反义链，所述探针的5′末端标记荧光基团，所述探针的3′末端结合有小沟结合分子；

所述通用引物特异识别ARMS突变位点识别引物的5′末端通用序列。

7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述ARMS引物为SEQ ID No:2和SEQ IDNo:6所示的核苷酸序列；

优选地，所述Taqman-MGB探针为SEQ ID No:7所示的核苷酸序列；

更优选地，所述通用引物为SEQ ID No:8所示的核苷酸序列。

8.根据权利要求6或7所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒由PCR缓冲液mix、引物对、Taqman-MGB探针和模板DNA组成，其中，所述引物对包括ARMS特异上、下游引物和通用引物；

优选地，所述各组分反应时终浓度为：

PCR缓冲液mix的终浓度为1×；

ARMS特异上、下游引物的终浓度为250-900nM；

通用引物的终浓度为250-900nM；

Taqman-MGB探针的终浓度为50-250nM；和/或

模板DNA的终浓度为0.05-1.5ng/μl。

9.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于：所述ARMS突变位点识别引物终浓度为12.5nM，所述非突变位点识别引物的终浓度为500nM；

所述通用引物的终浓度为500nM；和/或

所述Taqman-MGB探针的终浓度为250nM。

10.权利要求1-3中任一项所述方法或根据权利要求4-9中任一项所述试剂盒在制备用于基因突变检测的产品中的应用；优选地，所述基因突变为稀有突变。