[发明专利]一种益生菌制剂及其制备方法和应用

权利要求书

1.一种益生菌制剂在改善水体或者池塘底质中的应用，其特征在于，所述益生菌制剂为由芽孢杆菌、乳酸菌、酵母菌和光合菌通过液态发酵制备得到，所述芽孢杆菌由枯草芽孢杆菌和纳豆芽孢杆菌组成，所述乳酸菌由植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌和干酪乳杆菌组成，所述酵母菌由产朊假丝酵母和酿酒酵母组成，所述光合菌为沼泽红假单胞菌；所述益生菌制剂中芽孢杆菌的活菌个数为3×10⁷CFU/mL-9×10⁷CFU/mL，所述乳酸菌的活菌个数为1×10⁹CFU/mL-9×10⁹CFU/mL，所述酵母菌的活菌个数为1×10⁷CFU/mL-7×10⁷CFU/mL，所述光合菌的活菌个数为4×10⁵CFU/mL-6×10⁵CFU/mL；所述芽孢杆菌中枯草芽孢杆菌的活菌个数为4×10⁷CFU/mL-9×10⁷CFU/mL，纳豆芽孢杆菌的活菌个数为3×10⁷CFU/mL-8×10⁷CFU/mL；所述乳酸菌中植物乳杆菌的活菌个数为2×10⁹CFU/mL-8×10⁹CFU/mL，嗜酸乳杆菌的活菌个数为1×10⁹CFU/mL-8×10⁹CFU/mL，干酪乳杆菌的活菌个数为1×10⁹CFU/mL-5×10⁹CFU/mL；所述酵母菌中产朊假丝酵母的活菌个数为1×10⁷CFU/mL-6×10⁷CFU/mL，酿酒酵母的活菌个数为4×10⁷CFU/mL-6×10⁷CFU/mL；所述光合菌中沼泽红假单胞菌的活菌个数为4×10⁵CFU/mL-6×10⁵CFU/mL；所述益生菌制剂的pH值为3.5以下；枯草芽孢杆菌源自广东省微生物菌种保藏中心，编号为：GIM1.271；纳豆芽孢杆菌源自苏州北纳创联生物技术有限公司，编号为：BNCC 185324；植物乳杆菌源自广东省微生物菌种保藏中心，编号为：GIM1.191；嗜酸乳杆菌源自广东省微生物菌种保藏中心，编号为：GIM1.208；干酪乳杆菌源自广东省微生物菌种保藏中心，编号为：GIM1.204；产朊假丝酵母源自广东省微生物菌种保藏中心，编号为：GDM2.148；酿酒酵母源自广东省微生物菌种保藏中心，编号为：GIM2.213；沼泽红假单胞菌源自广东省微生物菌种保藏中心，编号为：GIM1.167；

所述液态发酵的方法包括以下步骤：

(1)原菌种活化：将枯草芽孢杆菌和纳豆芽孢杆菌分别接种到已灭菌的斜面培养基I中好氧培养直至长出菌落，将冷冻保藏的植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌和干酪乳杆菌分别接种到已灭菌的斜面培养基II中好氧培养直至长出菌落，将产朊假丝酵母和酿酒酵母分别接种到已灭菌的斜面培养基III中好氧培养直至长出菌落，将沼泽红假单胞菌接种到已灭菌的斜面培养基IV中厌氧培养直至长出菌落，得到各自活化斜面菌种；

所述斜面培养基I含有牛肉膏1-5g、蛋白胨5-15g、氯化钠2-8g、琼脂10-30g和蒸馏水1L且pH值为7.2-7.5；所述斜面培养基II含有蛋白胨5-15g、牛肉粉2-8g、酵母粉2-8g、葡萄糖10-30g、吐温80 0.5-2mL、磷酸氢二钾1-5g、乙酸钠2-8g、柠檬酸三铵1-5g、硫酸镁0.1-1g、硫酸锰0.01-0.1g、琼脂粉10-30g和蒸馏水1L且pH值为6.2-6.5；所述斜面培养基III含有葡萄糖10-30g、蛋白胨10-30g、酵母膏5-15g、氯霉素0.05-0.2g、琼脂粉10-30g和蒸馏水1L且pH自然；所述培养基IV含有蛋白胨1-5g、酵母膏1-5g、氯化钙0.1-1g、硫酸镁0.1-1g、琼脂粉10-30g和蒸馏水1L且pH值为6.8-7.0；

(2)一级种子液的制备：分别将由步骤(1)得到的枯草芽孢杆菌斜面菌种和纳豆芽孢杆菌斜面菌种至少部分接种到已灭菌的液体培养基I中，于30-40℃好氧培养20-30h，分别得到各自芽孢杆菌原菌液；分别将由步骤(1)得到的植物乳杆菌斜面菌种、嗜酸乳杆菌斜面菌种和干酪乳杆菌斜面菌种至少部分接种到已灭菌的液体培养基II中，于30-40℃厌氧培养18-30h，分别得到各自乳酸菌原菌液；分别将由步骤(1)得到的产朊假丝酵母斜面菌种和酿酒酵母斜面菌种至少部分接种到已灭菌的液体培养基III中，于28-30℃好氧培养40-50h，分别得到各自酵母菌原菌液；将步骤(1)得到的沼泽红假单胞菌斜面菌种至少部分接种到已灭菌的液体培养基IV中，在钨丝灯照射的条件下，于28-30℃厌氧培养2-4d，得到沼泽红假单胞菌原菌液；

所述液体培养基I含有牛肉膏1-5g、蛋白胨5-15g、氯化钠2-8g和蒸馏水1L且pH值为7.2-7.5；所述液体培养基II含有蛋白胨5-15g、牛肉粉2-8g、酵母粉2-8g、葡萄糖10-30g、吐温80 0.5-2mL、磷酸氢二钾1-5g、乙酸钠2-8g、柠檬酸三铵1-5g、硫酸镁0.1-1g、硫酸锰0.01-0.1g和蒸馏水1L且pH值为6.2-6.5；所述液体培养基III含有葡萄糖10-30g、蛋白胨10-30g、酵母膏5-15g、氯霉素0.05-0.2g和蒸馏水1L且pH值自然；所述液体培养基IV含有蛋白胨1-5g、酵母膏1-5g、氯化钙0.1-1g、硫酸镁0.1-1g和蒸馏水1L且pH值为6.8-7.0；

(3)二级种子液的制备：将步骤(2)得到的植物乳杆菌原菌液、嗜酸乳杆菌原菌液和干酪乳杆菌原菌液各自独立地按0.5-2wt％的接种量接种到已灭菌的同一发酵培养基I中，于30-40℃厌氧培养18-20h，得到复合乳酸菌二级种子液；

(4)益生菌发酵：将枯草芽孢杆菌原菌液、纳豆芽孢杆菌原菌液、产朊假丝酵母原菌液、酿酒酵母原菌液与沼泽红假单胞菌原菌液各自独立地按0.5-2wt‰接种量接入已灭菌的同一发酵培养基II中，于30-40℃有氧发酵18-20h，之后再以5-10wt％的接种量接入所述复合乳酸菌二级种子液，将pH值调节至6.5-7，之后于30-40℃厌氧发酵24-48h；

所述发酵培养基I和第二发酵培养基II的组分相同或不同，且各自独立地含有糖蜜30-50g、酵母膏1-2g、磷酸氢二钾0.2-0.25g、硫酸镁0.2-0.25g、硫酸锰0.05-0.1g和蒸馏水1L且pH值为7.2-7.5。