[发明专利]一种检测染色体重复片段断裂位点和定位信息的方法

权利要求书

1.一种检测染色体重复片段断裂位点和定位信息的方法，其特征在于，在染色体芯片分析得到拷贝数重复片段基础信息后，设计靶向捕获引物，特异性扩增拷贝数重复断裂位点附近区域的序列，靶向捕获断裂位点可能所在大致区域的序列，富集包含断裂位点的基因序列并构建文库进行高通量测序，通过生物信息学分析得到拷贝数重复片段的所在位置。

2.根据权利要求1所述检测染色体重复片段断裂位点和定位信息的方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)准备通用接头；

通用接头序列1：5’pCCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGCTGGCG*T

通用接头序列2：5’CGCCAGGTTCCAGTCA3’

(2)设计断裂位点区域特异性引物；

(3)锚定引物靶向捕获；

a.利用超声破碎仪对样本进行处理，使基因组DNA在处理后最大片段峰值为1200bp；

b.末端修复和加A尾；c.连接通用接头；d.第一轮锚定巢式PCR；e.第二轮引物巢式PCR；f.混合所有锚定PCR产物作为捕获区域扩增子；g.将混合后的PCR产物破碎至适合文库构建的大小；

(4)对捕获的扩增子进行建库并测序，通过下游生物信息学分析得到断裂位点的具体位置和附近序列信息。

3.根据权利要求2所述检测染色体重复片段断裂位点和定位信息的方法，其特征在于，所述断裂位点区域特异性引物设计包括如下步骤：

(1)：根据染色体芯片检测结果，导出断裂位点可能所在区域染色体坐标；

(2)：利用Primer3设计区域特异性引物，避开与测序平台接头序列冲突的序列；

(3)：利用BLAT将区域特异性引物和全基因组进行匹配，确保引物的特异性；

(4)：对两轮巢式PCR的区域特异性引物进行检查，保证相邻的引物不会互相影响；

(5)：检查所有引物3’端12个碱基的特异性。

4.根据权利要求2所述检测染色体重复片段断裂位点和定位信息的方法，其特征在于，具体方法如下：

(1)准备通用接头

通用接头序列1：5’pCCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGCTGGCG*T

通用接头序列2：5’CGCCAGGTTCCAGTCA3’

通用接头序列1和2同时稀释到100pmol/L浓度，在一个PCR反应管分别加入50ul去离子水，以及100pmol/L的通用接头序列1和2各25ul；95℃2分钟，取出放置室温20分钟后，-20℃保存；

(2)设计断裂位点区域特异性引物

根据染色体芯片检测结果，导出断裂位点可能所在区域染色体坐标；

利用Primer3设计区域特异性引物，避开与测序平台接头序列冲突的序列；

利用BLAT将区域特异性引物和全基因组进行匹配，确保引物的特异性；

对两轮巢式PCR的区域特异性引物进行检查，保证相邻的引物不会互相影响；

检查所有引物3’端12个碱基的特异性；

(3)锚定引物靶向捕获

a.利用超声破碎仪对样本进行处理，使基因组DNA在处理后最大片段峰值为1200bp；AgencourtAMPureXP磁珠纯化破碎到适当长度的样本DNA，洗脱体积为27ul；

b.末端修复和加A尾

末端修复：破碎并纯化后DNA25ul，NEBEndRepairBuffer10ul，NEBEndRepairEnzymemix5ul，水60ul，总量为100ul；20℃30分钟后取出，AgencourtAMPureXP磁珠纯化，洗脱体积为22ul；

加A尾：末端修复并纯化后DNA20ul，NEBdAtailingBuffer5ul，Klenow3ul，水22ul，总量50ul；37℃30分钟后取出，AgencourtAMPureXP磁珠纯化，洗脱体积为53ul；Nanodrop定量纯化后样本作为质控，如起始样本量为2ug，此时纯化后浓度约为20ng/ul；

c.连接通用接头

上步中纯化后样本50ul，10XLigationBuffer10ul,通用接头0.5ul，T4DNALigase5ul，水34.5ul，总量为100ul；混匀后室温1小时，QiagenPCRpurificationkit纯化，洗脱体积为23ul；

d.第一轮锚定巢式PCR

反应体系为25ul；10XHighFidelityPCRBuffer2.5ul，50mgMgSO₄1ul，10mMdNTP0.5ul，PCR1引物0.5ul，锚定引物0.5ul，模板1ul，TaqDNAPolymeraseHighFidelity0.1ul，水18.9ul；

PCR条件：94℃预变性2分钟；94℃变性30秒，58℃退火30秒，68℃延伸1分钟，25个循环；68℃延伸2分钟；4℃保存；

AgencourtAMPureXP磁珠纯化，洗脱体积为15ul；

e.第二轮引物巢式PCR

反应体系为50ul；10XHighFidelityPCRBuffer5ul，50mgMgSO42ul，10mMdNTP1ul，PCR1引物1ul，锚定引物1ul，模板2ul，TaqDNAPolymeraseHighFidelity0.2ul，水37.8ul；

PCR条件：94℃预变性2分钟；94℃变性30秒，58℃退火30秒，68℃延伸1分钟，25个循环；68℃延伸2分钟；4℃保存；

AgencourtAMPureXP磁珠纯化，洗脱体积为22ul；Nanodrop定量纯化后PCR产物作为质控，浓度为90ng/ul；

f.混合所有锚定PCR产物作为捕获区域扩增子

等比例混合所有PCR产物；

g.将混合后的PCR产物破碎至适合文库构建的大小

选用microTUBEAFAFiberSnap-Cap处理样本，容量为130ul；程序设置为：peakincidentpower(W):50；Dutyfactor:20％；cyclesperburst:200；Treatmenttime(s):75；使基因组DNA在处理后最大片段峰值为300bp；AgencourtAMPureXP磁珠纯化样本DNA，洗脱体积为45ul；

(4)对捕获的扩增子进行建库并测序，通过下游生物信息学分析得到断裂位点的具体位置和附近序列信息。