[发明专利]一种检测染色体重复片段断裂位点和定位信息的方法在审

专利信息
申请号: 201811121747.7 申请日: 2018-09-26
公开(公告)号: CN109161587A 公开(公告)日: 2019-01-08
发明(设计)人: 姚如恩;王剑;郁婷婷;沈亦平;李国强 申请(专利权)人: 上海交通大学医学院附属上海儿童医学中心
主分类号: C12Q1/6858 分类号: C12Q1/6858
代理公司: 上海卓阳知识产权代理事务所(普通合伙) 31262 代理人: 周春洪
地址: 200127 上*** 国省代码: 上海;31
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摘要:
搜索关键词: 位点 断裂 定位信息 拷贝数 染色体 种检测 重复 生物信息学分析 医学技术领域 高通量测序 大致区域 基础信息 基因序列 临床意义 序列信息 遗传诊断 低成本 基因组 靶向 富集 构建 捕获 文库 芯片 疾病 成熟 检验 咨询 分析
【权利要求书】:

1.一种检测染色体重复片段断裂位点和定位信息的方法,其特征在于,在染色体芯片分析得到拷贝数重复片段基础信息后,设计靶向捕获引物,特异性扩增拷贝数重复断裂位点附近区域的序列,靶向捕获断裂位点可能所在大致区域的序列,富集包含断裂位点的基因序列并构建文库进行高通量测序,通过生物信息学分析得到拷贝数重复片段的所在位置。

2.根据权利要求1所述检测染色体重复片段断裂位点和定位信息的方法,其特征在于,包括如下步骤:

(1)准备通用接头;

通用接头序列1:5’pCCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGCTGGCG*T

通用接头序列2:5’CGCCAGGTTCCAGTCA3’

(2)设计断裂位点区域特异性引物;

(3)锚定引物靶向捕获;

a.利用超声破碎仪对样本进行处理,使基因组DNA在处理后最大片段峰值为1200bp;

b.末端修复和加A尾;c.连接通用接头;d.第一轮锚定巢式PCR;e.第二轮引物巢式PCR;f.混合所有锚定PCR产物作为捕获区域扩增子;g.将混合后的PCR产物破碎至适合文库构建的大小;

(4)对捕获的扩增子进行建库并测序,通过下游生物信息学分析得到断裂位点的具体位置和附近序列信息。

3.根据权利要求2所述检测染色体重复片段断裂位点和定位信息的方法,其特征在于,所述断裂位点区域特异性引物设计包括如下步骤:

(1):根据染色体芯片检测结果,导出断裂位点可能所在区域染色体坐标;

(2):利用Primer3设计区域特异性引物,避开与测序平台接头序列冲突的序列;

(3):利用BLAT将区域特异性引物和全基因组进行匹配,确保引物的特异性;

(4):对两轮巢式PCR的区域特异性引物进行检查,保证相邻的引物不会互相影响;

(5):检查所有引物3’端12个碱基的特异性。

4.根据权利要求2所述检测染色体重复片段断裂位点和定位信息的方法,其特征在于,具体方法如下:

(1)准备通用接头

通用接头序列1:5’pCCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGCTGGCG*T

通用接头序列2:5’CGCCAGGTTCCAGTCA3’

通用接头序列1和2同时稀释到100pmol/L浓度,在一个PCR反应管分别加入50ul去离子水,以及100pmol/L的通用接头序列1和2各25ul;95℃2分钟,取出放置室温20分钟后,-20℃保存;

(2)设计断裂位点区域特异性引物

根据染色体芯片检测结果,导出断裂位点可能所在区域染色体坐标;

利用Primer3设计区域特异性引物,避开与测序平台接头序列冲突的序列;

利用BLAT将区域特异性引物和全基因组进行匹配,确保引物的特异性;

对两轮巢式PCR的区域特异性引物进行检查,保证相邻的引物不会互相影响;

检查所有引物3’端12个碱基的特异性;

(3)锚定引物靶向捕获

a.利用超声破碎仪对样本进行处理,使基因组DNA在处理后最大片段峰值为1200bp;AgencourtAMPureXP磁珠纯化破碎到适当长度的样本DNA,洗脱体积为27ul;

b.末端修复和加A尾

末端修复:破碎并纯化后DNA25ul,NEBEndRepairBuffer10ul,NEBEndRepairEnzymemix5ul,水60ul,总量为100ul;20℃30分钟后取出,AgencourtAMPureXP磁珠纯化,洗脱体积为22ul;

加A尾:末端修复并纯化后DNA20ul,NEBdAtailingBuffer5ul,Klenow3ul,水22ul,总量50ul;37℃30分钟后取出,AgencourtAMPureXP磁珠纯化,洗脱体积为53ul;Nanodrop定量纯化后样本作为质控,如起始样本量为2ug,此时纯化后浓度约为20ng/ul;

c.连接通用接头

上步中纯化后样本50ul,10XLigationBuffer10ul,通用接头0.5ul,T4DNALigase5ul,水34.5ul,总量为100ul;混匀后室温1小时,QiagenPCRpurificationkit纯化,洗脱体积为23ul;

d.第一轮锚定巢式PCR

反应体系为25ul;10XHighFidelityPCRBuffer2.5ul,50mgMgSO41ul,10mMdNTP0.5ul,PCR1引物0.5ul,锚定引物0.5ul,模板1ul,TaqDNAPolymeraseHighFidelity0.1ul,水18.9ul;

PCR条件:94℃预变性2分钟;94℃变性30秒,58℃退火30秒,68℃延伸1分钟,25个循环;68℃延伸2分钟;4℃保存;

AgencourtAMPureXP磁珠纯化,洗脱体积为15ul;

e.第二轮引物巢式PCR

反应体系为50ul;10XHighFidelityPCRBuffer5ul,50mgMgSO42ul,10mMdNTP1ul,PCR1引物1ul,锚定引物1ul,模板2ul,TaqDNAPolymeraseHighFidelity0.2ul,水37.8ul;

PCR条件:94℃预变性2分钟;94℃变性30秒,58℃退火30秒,68℃延伸1分钟,25个循环;68℃延伸2分钟;4℃保存;

AgencourtAMPureXP磁珠纯化,洗脱体积为22ul;Nanodrop定量纯化后PCR产物作为质控,浓度为90ng/ul;

f.混合所有锚定PCR产物作为捕获区域扩增子

等比例混合所有PCR产物;

g.将混合后的PCR产物破碎至适合文库构建的大小

选用microTUBEAFAFiberSnap-Cap处理样本,容量为130ul;程序设置为:peakincidentpower(W):50;Dutyfactor:20%;cyclesperburst:200;Treatmenttime(s):75;使基因组DNA在处理后最大片段峰值为300bp;AgencourtAMPureXP磁珠纯化样本DNA,洗脱体积为45ul;

(4)对捕获的扩增子进行建库并测序,通过下游生物信息学分析得到断裂位点的具体位置和附近序列信息。

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