[发明专利]纳米材料胁迫下桡足类DNA损伤的检测方法

说明书

本发明公开了纳米材料胁迫下桡足类DNA损伤的检测方法，包括样品提取、细胞存活率测定、体外暴露、DNA损伤的检测，DNA损伤的检测为：将体外暴露得到的沉淀细胞团用PBS或HBSS平衡盐溶液重悬沉淀细胞团，离心，去除上清液得单细胞悬液；将单细胞悬液利用琼脂糖制成胶板；将胶板浸入含有DMF和二甲基甲酰胺的工作液中裂解；将裂解后的胶板置于电泳液中，解旋后电泳；将电泳后的胶板用Tris‑HCl中和；将中和后的胶板染色后在荧光显微镜下观察，拍摄，使用CASP彗星图像分析软件自动分析。本发明检测方法具有简便、快速、低耗、灵敏性和准确性高、重复性好、成本较低等独特优点，所需样本量少。

技术领域

本发明涉及生态基因毒理学技术领域，尤其是涉及纳米材料胁迫下桡足类DNA损伤的检测方法。

技术背景

纳米材料由于具有比表面积大和表面缺陷产生的一系列新的不同于宏观物质的特性，目前已被广泛应用于涂料、染料、电子、医药、国防、服装、化妆品、日用品、生物医药、农业、航天航空等多个领域。随着纳米材料在工业中广泛应用，纳米污染问题日益严重，纳米材料可以通过河水、降雨等过程将转移至海洋环境中，并通过食物链和食物网在生物体内蓄积并持久存在，对生物和生态环境带来严重威胁。纳米尺度颗粒物会严重影响着细胞、亚细胞和蛋白质的生理活性，甚至会造成细胞的死亡。纳米材料通过各种方式进入机体内，并沉积到相应细胞(神经细胞、肝脏细胞等)内，可使蛋白质变性或者降低酶活性，严重的可造成基因毒性、DNA突变、细胞膜和细胞器(主要是线粒体)损伤，最终会影响功能蛋白的表达和机体免疫力等。测定DNA损伤程度，用于评估污染物的行为与毒性，探究其对机体的遗传毒性的影响具有重要的意义。

桡足类是近海的优势浮游生物群体，处于食物链第二营养级，因为其具有生活周期短，分布广泛、滤食性及蓄积性的特点，被广泛应用于毒理学研究。使用桡足类作为模式生物，模拟环境中纳米材料水平测定桡足类体内细胞DNA损伤水平，从而判断纳米材料对于海洋生物的胁迫压力。DNA损伤包括单链损伤、双链损伤、链内交联、链间交联、碱基修饰、腺嘌呤丢失等，检测DNA损伤可根据DNA的基本成分进行，如32P-后标记-薄层层析法、气相色谱-质谱-选择性离子测量分析方法(GC-MS-SIM)等。然而，这些方法往往都存在需要对样品进行预处理，耗时长、所需仪器相对较贵、操作繁琐、灵敏度与特异性较差、易产生交叉反应和环境污染、通量低而且检测对象单一等不足等缺点。现今用于DNA损伤检测较为广泛使用的是单细胞凝胶电泳的方法，又称彗星实验，是一种在单细胞水平进行DNA损伤的检测方法，具有简便、快速、低耗、重复性好等独特优点，不仅能够直接观察单个细胞内的DNA损害和快速并大通量检验真核细胞DNA损伤与修复、DNA双链和单链断裂，还能检测到DNA的碱基的不稳定结构。但目前研究多采用测定桡足类体内细胞DNA损伤水平，从而判断纳米材料对于海洋生物的胁迫压力的报道尚未见到。因此，建立一种快速、方便、高灵敏性并且能检测桡足类DNA损伤的方法就显得尤其重要。

发明内容

本发明的目的在于提供一种具有简便、快速、低耗、灵敏性和准确性高、重复性好、成本较低等独特优点，所需样本量少的纳米材料胁迫下桡足类DNA损伤的检测方法。

本发明针对背景技术中提到的问题，采取的技术方案为：

纳米材料胁迫下桡足类DNA损伤的检测方法，包括样品提取、细胞存活率测定、体外暴露、DNA损伤的检测，DNA损伤的检测为：

a单细胞悬液制备：将体外暴露得到的沉淀细胞团用PBS或HBSS平衡盐溶液重悬沉淀细胞团，离心，去除上清液得单细胞悬液；

b胶板制备：将单细胞悬液利用琼脂糖制成胶板；

c裂解：将胶板浸入含有DMF和二甲基甲酰胺的工作液中，在0-5℃黑暗条件下裂解15-20min；

d电泳：将裂解后的胶板置于电泳液中，在0-5℃黑暗条件下解旋后电泳；

e中和：将电泳后的胶板用0.4mol/L的Tris-HCl中和；