[发明专利]耐辐射异常球菌角蛋白酶基因kerA的应用有效

专利信息
申请号: 201811124474.1 申请日: 2018-09-26
公开(公告)号: CN109266634B 公开(公告)日: 2021-10-01
发明(设计)人: 林敏;周正富;王劲;耿秀秀;张维;陈明 申请(专利权)人: 中国农业科学院生物技术研究所
主分类号: C12N9/50 分类号: C12N9/50;C12N15/57;C12N15/70;C12N1/21;C12Q1/37;C12R1/19
代理公司: 北京海虹嘉诚知识产权代理有限公司 11129 代理人: 张涛
地址: 100081 北*** 国省代码: 北京;11
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摘要:
搜索关键词: 辐射 异常 球菌 角蛋白 基因 kera 应用
【说明书】:

发明从极端菌株耐辐射异常球菌中发现了一种具有降解复杂结构蛋白功能的基因KerA。本发明构建了含有该基因的重组载体,将其在原核宿主细胞大肠杆菌中表达。实验证明,所述基因在原核宿主细胞中表达后,能降解复杂结构蛋白质的功能,可用于蛋白酶催化生物降解及相关工业生产中。

技术领域

本发明属于生物降解技术领域,涉及耐辐射异常球菌角蛋白酶KerA基因降解复杂结构的蛋白质、发挥碱性蛋白酶水解的功能。

背景技术

酶作为一种重要的生物催化剂,在生物化学反应中发挥十分重要的作用,较化学催化剂,酶的催化作用所需条件温和。无论在蛋白质工程、细胞工程、基因工程和发酵工程都需要各种酶的参与,酶工程技术己成为生物工程技术的重要组成部分。其中,蛋白酶在工业酶中用得最多,约占用酶总量的60%,而碱性蛋白酶占37%。

碱性蛋白酶是指在碱性条件下水解蛋白质肽键的一类蛋白酶的总称,属于丝氨酸蛋白水解酶类。微生物碱性蛋白酶一般在pH为7-11范围内有活性,最适pH多为9.5-10.5。多数微生物碱性蛋白酶不具有耐热性,在50-60℃维持较长时间便大量失活,只有少数菌株产生的碱性蛋白酶能够耐受70℃的高温。这些情况限制了碱性蛋白酶的使用范围,人们需要找到pH范围和温度范围更宽的碱性蛋白酶用于实际生产中。

发明内容

异常球菌属菌株分离于温泉、沙漠、冰山及南极等各种各样的环境,所有的异常球菌属物种均具有极强的胁迫逆境抗性及超强的环境适应性。在这种极端的环境下,这些微生物经过长期的选择压力下,进化出一系列适应该生境的基因种质资源。菌株基因组中丰富的功能酶编码基因值得进行更加深入的研究。

本发明的目的是从耐辐射异常球菌Deinococcus radiodurans中发掘鉴定了一种用于复杂结构蛋白降解的碱性蛋白酶基因。

通过如下研究,首次发掘鉴定了耐辐射异常球菌KerA基因(GeneID:RS01950;ProteinID:WP_027480084)可用于微生物催化的生物降解。具体研究工作如下:

1、获得了含有KerA基因的重组工程菌株

1)通过PCR从耐辐射异常球菌基因组扩增出KerA基因,基因序列号为:GeneID:RS01950。其大小为1599bp,该基因编码532个氨基酸,将其克隆于载体pJET上,构建了含有完整KerA基因的重组质粒pJET-KerA;

2)将KerA基因连接于pET22b质粒上,该质粒含诱导型T7启动子和前导肽pelB,可将诱导表达的靶标蛋白释放到培养液中。构建完成的重组质粒pET22-KerA;

3)将导入KerA基因的重组质粒pET22-KerA转入受体大肠杆菌BL21(DE3)中,获得工程菌株BL21-KerA(详见实施例1);

2、含有KerA基因重组工程菌株的生物降解检测实验及蛋白酶活性测定分析

本发明进行了如下生物降解检测实验:

1)平板降解圈实验:实验结果显示,表达KerA蛋白酶的重组工程菌株在脱脂乳平板上能够生长并产生明显的降解圈。

2)羽毛降解实验:实验证实,并KerA蛋白酶具有降解鸡羽毛的活性(详见实施例2)。

结果说明,表达KerA的重组大肠杆菌工程菌株具有分泌蛋白酶的能力,该蛋白酶能够降解脱脂乳蛋白和鸡羽毛等复杂结构蛋白。

本发明还进行了蛋白酶活性测定分析。30℃诱导培养条件下,工程菌BL21-KerA在诱导8h后可以检测出胞外蛋白酶酶活,粗酶液酶活为137.1U/mg(详见实施例3)。羽毛降解发酵液中氨基酸种类与含量分析显示,降解产物主要产生精氨酸、酪氨酸、脯氨酸、胱氨酸等21种氨基酸(详见实施例4)。

序列表信息

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