[发明专利]具有增强的β-葡糖苷酶活性的高产里氏木霉菌株

说明书

本发明涉及一种高产并且具有增强的β‑葡糖苷酶活性的里氏木霉菌株，以及所述菌株的用途。

技术领域

本发明涉及一种高产并且具有增强的β-葡糖苷酶活性的里氏木霉菌株，以及所述菌株的用途。

背景技术

里氏木霉(T.reesei)是一种分解纤维素的木霉属丝状真菌种，其在第二次世界大战期间在南太平洋被发现。该真菌能够分泌大量纤维素类的酶(纤维素酶和半纤维素酶)，目前主要用于第二代生物燃料的生产过程。实际上，由该真菌产生的酶特别适用于将植物生物质材料转化为可用于工业的生物产物，例如生物乙醇。

鉴于第一代生物燃料(来源于食物资源)只能以有限数量生产，因为它们与食品生产竞争，因此目前特别关注第二代生物燃料(来源于非食物资源)。

第二代生物燃料的生产过程包括四个主要步骤：木质纤维素生物质的预处理，木质纤维素生物质的酶促水解、发酵和蒸馏。

虽然生产第二代生物燃料的所有步骤都可以而且必须进行优化-以便增加产量-但是特别努力集中在酶促水解步骤上。该水解步骤涉及由丝状真菌里氏木霉产生的纤维素酶类型的酶。

更通常地，里氏木霉可以用作平台菌株来生产目标同源或异源蛋白质。为了优化里氏木霉的性能，必须增强产生目标蛋白质的里氏木霉菌株。

因此，在所预期的增强方法中，里氏木霉的基因工程是一种解决方案。它可以在工业条件下增强产纤维素酶丝状真菌的分泌性能、酶的性质，并控制菌株的稳定性。

诱变是基因工程中常用的技术。它旨在自发地在DNA中引入突变以产生遗传修饰的基因。从工业角度来看，这可以产生具有令人感兴趣特征的菌株。常规使用两种诱变方法在里氏木霉中引入突变：随机诱变和定向诱变。

随机诱变包括在DNA中的任何地方诱导非靶向突变。通过将靶生物暴露于诱变化学剂或辐射来引发这些突变。鉴于突变是一种自然现象，因此随机诱变被认为是这种自然过程的加速器，由此获得的生物被认为是天然的而不是转基因生物(GMO)；因此，它们不受制于可追溯性要求。然而，除了导致目标特征的突变之外，该方法还诱导大量不期望的所谓“附带”突变，其通过积累而促成突变生物的不稳定性、健康不良或甚至致命性。

定向诱变可以将经鉴定的突变引入特定基因。为此目的，合成含有突变的目标DNA，然后将其引入待突变的细胞中，其中DNA修复机制负责将其整合入基因组中。选择标记的使用使得可以从未整合突变的细胞中鉴定已经整合突变的细胞。然而，经历这种诱变的生物被认为是GMO(由于引入了外源DNA)，因此受制于可追溯性要求。

因此，在使用里氏木霉生产第二代生物燃料的情况下，通过将(随机或定向)突变引入里氏木霉来增强水解步骤并不能令人满意，因为引起不希望的突变的积累，或者实际上是引入了外源DNA。因此，需要一种增强水解步骤的新方法。

迄今为止，里氏木霉的有性繁殖从未被用作增强工具，因为一直认为里氏木霉不能进行有性繁殖。然而，里氏木霉有性状态的发现(Seidl等，2009)为菌株的遗传增强开辟了新的可能性。尤其是，有性繁殖使得可以产生遗传多样性、保留有益突变并从基因组中去除“附带”突变。因此，本发明的发明人试图通过有性繁殖，特别是通过将里氏木霉的野生菌株和工业菌株杂交来开发里氏木霉的分解纤维素的性能。

发明内容

因此，本发明基于本发明人的发现，其主要贡献在于在无数次试验后获得高产纤维素分解酶的新型里氏木霉菌株。如实施例1中所述，该菌株通过将纤维素酶高产菌株RutC30(Montenecourt和Eveleigh，1977)与菌株A2(衍生自来源于自育菌株CBS999.97的分离的子囊孢子的菌株)杂交而获得。令人惊讶的是，在根据本发明的菌株产生的纤维素分解酶中，酶β-葡糖苷酶表现出增强的活性(与亲本RutC30和A2的活性相比)。根据本发明的菌株也是MAT1-1交配型并且是可育的。