[发明专利]一种细胞表面标记特异性富集的人牙根尖乳头干细胞微胶囊及其制备方法

权利要求书

1.一种通过细胞表面标记特异性富集的人牙根尖乳头干细胞微胶囊，其特征在于：

所述干细胞为人牙根尖乳头干细胞，所述的人年龄是19至29岁，所述细胞表面标记选自CD18，STRO-1，CD106/VCAM-1，CD146/MUC-18，HOP-26，CD49A/整合素β1，SB-10/CD166中的一个或多个；

所述微胶囊包括微球内核及外壳，所述微球直径小于500μm；

所述微胶囊材料选自胶原，藻酸盐，壳聚糖，透明质酸中的一种或多种。

2.权利要求1所述的人牙根尖乳头干细胞微胶囊，其特征在于，以CD18作为细胞表面标记，所述CD18使用荧光标记或磁珠标记。

3.权利要求2所述的人牙根尖乳头干细胞微胶囊，其特征在于，所述微胶囊内核材料选自藻酸盐。

4.权利要求3所述的人牙根尖乳头干细胞微胶囊，其特征在于，所述微胶囊外壳材料选自壳聚糖膜，所述壳聚糖膜为共价交联。

5.一种权利要求4所述人牙根尖乳头干细胞微胶囊的制备方法，其特征在于，所述方法的具体步骤如下：

步骤1，将藻酸盐溶解于PBS中，配成1-3%的藻酸盐溶液，经0.22μm的滤膜过滤，分装保存；

步骤2，将培养至第四代的CD18阳性牙根尖乳头干细胞经胰酶消化，900rpm离心5min，用PBS洗细胞一次；

步骤3，用藻酸盐溶液重悬步骤2得到的CD18阳性牙根尖乳头干细胞，调整细胞浓度为(1-2)×10⁶/ml；

步骤4，通过水平、竖直双通道微流体装置，将含有细胞的藻酸盐溶液经通道向下滴入装有0.1-0.2M氯化钙溶液的平皿中，形成细胞微球；大豆油经通道横向流动，截断藻酸盐溶液，控制细胞微球的大小；

步骤5，将微球在37℃条件下孵育15-45分钟，待完全交联形成；

步骤6，将藻酸盐细胞微球在(0.1-1)%壳聚糖溶液中包被15-45分钟；

步骤7，随后置于1-5 mg/ml京尼平水溶液中37℃条件下孵育1-10小时完成交联，制备细胞微胶囊；

步骤8，用α-MEM对细胞微胶囊进行清洗和收集，并接种于含10％-20% 胎牛血清、50μM-200μM的抗坏血酸2-磷酸酯、2mM谷氨酰胺、100U/mL青霉素、100μg/mL链霉素的α-MEM培养基中，置于37℃、5％ CO₂的孵箱中培养；

步骤9，采用光学显微镜观察形成的细胞微胶囊的形状和直径。

6.一种权利要求5所述人牙根尖乳头干细胞微胶囊的制备方法，其特征在于，所述培养至第四代的CD18阳性牙根尖乳头干细胞的制备步骤如下：

步骤1，收集正常的成人拔除智齿，立即置于4℃预冷的含50-300U/mL青霉素、50-300μg/mL链霉素、和1-5μg/mL二性霉素B的α-MEM培养基中，2℃-8℃条件下运至洁净实验室，所述成人年龄为19到29岁，从收集到开始提取牙根尖乳头干细胞的时间间隔不超过72小时；

步骤2，转移至生物安全柜，取出智齿至培养皿，用4℃预冷的无菌磷酸盐缓冲液清洗，即PBS清洗其外表面；

步骤3，用无菌手术刀轻轻从牙根部切下根尖乳头，切碎；

步骤4，将牙根尖乳头组织置于含1-10 mg/ml I型胶原酶和1-10 mg/ml分散酶的PBS中，37℃消化30min；

步骤5，将消化液通过70微米的细胞筛过滤，获得含有人牙根尖乳头干细胞的单细胞悬液，900rpm离心5min，用PBS洗细胞一次；

步骤6，用PBS重悬细胞，加入CD18单抗，混匀，室温避光孵育30分钟；

步骤7，洗涤后，900rpm离心5min，用PBS重悬细胞；

步骤8，通过流式细胞仪分选或免疫磁珠分选，获得CD18阳性干细胞亚群；

步骤9，每3-4天换液，待细胞90%融合后，1：3传代，制备微球所用细胞为第四代。