[发明专利]罗汉果环氧化物水解酶Sgeph5基因的应用

说明书

本发明公开了一种罗汉果甜甙合成调控基因Sgeph5及其应用，属于生物技术领域。本发明通过罗汉果全基因组测序和不同组织RNA‑seq序列分析，并利用组织特异性和性状相关联的次生代谢途径，获得了罗汉果果实特异表达的罗汉果环氧化物水解酶Sgeph5基因。通过调节该基因的表达可调控罗汉果果实中甜甙含量，用以获得高甜甙含量的罗汉果新品种或品系，对于研究葫芦科植物果实口感机制和葫芦科植株果实口感育种工作具有重要的理论和实践意义。

技术领域

本发明属于植物生物技术领域，具体涉及葫芦科植物育种方法，包括提高甜甙含量和改善口感，更具体地涉及一种甜甙含量调控基因Sgeph5的核酸分子及其分子育种材料及其在葫芦科果实改良育种工作中的应用。

技术背景

罗汉果(Siraitia grosvenorii(Swingle)C.Jeffrey)作为中药使用已有几个世纪的历史。中国传统医学用其治疗高血压，肺结核，胃炎，哮喘，百日咳，急慢性气管炎和急慢性扁桃体炎等。近年研究还发现罗汉果含有抗癌成分，已引起国内外医学界的高度重视。罗汉果富含甜甙、黄酮、维生素、蛋白质、氨基酸、甘露醇、scavenger物质、多种微量元素等有效成分，营养价值高，天然风味浓郁，醇香甘甜，亦能广泛用于食品、保健品。罗汉果中甜苷V是世界最强甜味物质之一，甜度是甜菊苷的2倍，甘草甜素的6倍，蔗糖甜度的300倍，最大的优点是不含热量，理化性能稳定，水溶性好，无任何毒副作用，适合所有人群长期食用。罗汉果主要产于桂林市临桂县和永福县的山区，是桂林名贵的土特产，在湖南南部、贵州、广东和江西等省区亦有分布。

罗汉果的组织培养研究始于1980年，林荣等以罗汉果胚轴、茎尖等为外植体，进行了离休培养的初步研究。至今关于罗汉果的组织培养研究主要集中在离体快繁和脱病毒培养。罗汉果转基因研究几乎是空白。罗汉果抗虫和代谢基因工程研究进展包括：

1.抗虫基因工程

根结线虫病是罗汉果的一种重要病害，对生产威胁极大，导致植物开花结果推迟，结果少，果实小，甚至不开花，严重时主根腐烂，植物整体枯死，严重制约着罗汉果产业的快速健康发展。使用化学药品抗病能取得一些成效和收益，但长期使用易产生抗药性和农残问题，不能从根本上解决病害，应用现代分子育种和基因工程等高新技术将为罗汉果的发展打开新天地。

2.代谢基因工程

罗汉果的主要活性成分包括三萜及其苷类，还含有黄酮、多糖、氨基酸、甘露醇、维生素等。罗汉果甙属是葫芦烷三萜类，早在上世纪七、八十年代日本学者就对罗汉果的三萜类成分进行了较为系统的研究，从干燥果实中分离得到赛门苷Ⅰ(sianenosideⅠ)、罗汉果苷ⅡE、(mogrosideⅡE)、罗汉果苷(mogrosideⅢ)、罗汉果苷ⅢE(mogrosideⅢE)、罗汉果苷Ⅳ(mogrosideⅣ)、罗汉果苷Ⅴ(mogrosideⅤ)等葫芦烷型三萜类化合物。其中的罗汉果苷Ⅴ是罗汉果干果的主要成分，约占干果的0.5％。罗汉果苷Ⅳ、罗汉果苷Ⅴ、赛门苷Ⅰ的万分之一浓度的水溶液分别是5％蔗糖水溶液甜度的392倍、425倍、563倍。此后经过多位学者的努力，又从罗汉果中分离鉴定了大量的三萜皂苷、三萜酯等成分30多个。鲨烯是所有三萜皂苷、白桦酸、植物激素类化合物的共同前体，是由鲨烯合成酶(Squalence synthase，SS)催化两分子的焦磷酸金合欢酯(Farnesyl diphosphate，FPP)尾尾缩合而成的。因此，克隆代谢过程中关键酶是提高罗汉果中甜甙的有效途径。

知识产权方面主要集中在产品饮料配方方面较多，国外大公司以饮料配方为主要研究方向，国内研究主要在栽培种植及一些罗汉果茶饮方面。