[发明专利]一种能识别多种环境内分泌干扰物的体外快速检测方法

权利要求书

1.一种能识别多种环境内分泌干扰物的体外快速检测方法，其特征包括以下步骤：

步骤1，唾腺获取和预处理；

步骤2，离体染毒和样本收集；

步骤3，分子标志物EcR、Usp、E74表达量测定；

步骤4，数据统计与显著性分析。

2.根据权利要求1所述的能识别多种环境内分泌干扰物的体外快速检测方法，其特征在于，所述的步骤1包括：将摇蚊放入玻璃缸中，加入除氯自来水，并用纱网罩盖在缸上，温和曝气，每周换水一次，收集新产卵块，孵化后取四龄幼虫并分离出唾腺，在实验开始前用昆虫培养基冲洗15分钟，从每只幼虫中取出一对唾腺。

3. 根据权利要求1所述的能识别多种环境内分泌干扰物的体外快速检测方法，其特征在于，所述的步骤2包括：来自同一只幼虫的一对唾腺，一只用于处理组，另一只用于相应的对照组，至少设置5个浓度处理组，每个处理组至少6个平行；将分离出的唾腺置入试验溶液中，暴露3 h，分别在1 h和3 h取3个平行测试蜕皮激素受体基因EcR和Usp以及早期响应基因E74表达量。

4.根据权利要求1所述的能识别多种环境内分泌干扰物的体外快速检测方法，其特征在于，所述的步骤3包括：提取总RNA，利用分光光度计检测RNA的浓度和纯度；将提取的摇蚊总RNA反转录成cDNA，根据标志物基因序列设计并合成相应的引物序列并进行荧光定量PCR。

5. 根据权利要求1所述的能识别多种环境内分泌干扰物的体外快速检测方法，其特征在于，所述的步骤4包括：以GAPDH、Actin β为内参，计算处理组中分子标志物EcR、Usp、E74的表达量；以对照组中来自同一个体的唾腺的目标基因表达量为参照，计算处理组中EcR、Usp、E74的相对表达量，采用统计学方法计算显著影响分子标志物的表达量的最低浓度NOEC或10%效应浓度EC₁₀。