[发明专利]一种放线菌天然产物合成基因簇多拷贝整合方法

说明书

本发明公开了一种系统，其包括：含有多克隆位点MCS、链霉菌启动子kasOp*、整合基因、抗性基因、通用组装接头、SpeI和SwaI酶切位点的第一质粒；含有外源基因簇、整合基因、抗性基因、通用组装接头的第二质粒；CRISPR/Cas9反应体系；Gibson组装反应体系。该系统为即插即用型，可高效地在放线菌基因组上整合多拷贝的天然产物合成基因簇。

技术领域

本发明属于代谢工程领域，涉及一种用于在放线菌基因组上整合多拷贝基因簇的整合系统及其应用，具体涉及一种放线菌天然产物合成基因簇多拷贝整合方法和用于实施该方法的整合系统。

背景技术

微生物产生的具有生物活性的天然产物(又称次级代谢产物)是人类抵抗癌症、衰老和感染性疾病等的宝贵财富。以抗生素为例，据统计，在已报道的天然来源的抗生素中，有50％左右是由放线菌科的链霉菌产生的。抗生素生物合成基因簇包含了结构、抗性、外排、调控与后修饰等基因，基因簇大小一般在10-100kb不等。伴随着代谢工程的迅速发展，多种提高抗生素产量有利的策略被开发与应用，包括优化调控网络、减少竞争途径、提高耐受性以及扩增合成基因簇拷贝数等。这些策略避免了传统诱变筛选时所需大量的时间与人力成本，可有效优化次级代谢产物的生物合成。

吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)是一种在适当的条件下，可以生产5-酮米尔贝霉素(5-oxomilbemycin)的放线菌。5-酮米尔贝霉素的衍生物米尔贝肟已在美国、日本及中国台湾等地区广泛用于植物病虫害与动物寄生虫防治。因此构建高产5- 酮米尔贝霉素的工程菌将显著加快其衍生物米尔贝肟在国内的产业化进程。

尽管放线菌现已被较多地应用于生产各种重要的天然药物，但是鉴于其代谢机制复杂，生产过程中不确定因素较多，本领域仍然需要进一步开发优化其生物合成途径、优化调控网络等的技术，以期进一步地提高天然药物的产量。

为了在放线菌比如链霉菌的基因组上整合多拷贝的天然产物合成基因簇，考虑到放线菌基因组中天然存在着许多不同整合系统对应的attB位点的特点，前期我们已经开发了一种基于“一个整合酶-多个attB位点”理念的基因簇多拷贝扩增方法MSGE(Multiplexed Site-specific Genome Engineering)(Li et al.,MetabolicEngineering,2017)，其机理参见图1。该方法在体外基因簇编辑方法CGE(CRISPR/Cas9 andGibson assembly-assisted DNA Editing)的辅助下，克服了传统的放线菌基因组上多个attB位点需要人工引入、费时费力的缺陷，通过在含有目标基因簇的载体中直接添加上多套整合系统，可一步实现多拷贝插入。但是，后来的研究发现，该MSGE方法也存在一些缺陷，比如，要想一步实现4个以上拷贝同时插入比较困难，成功率较低；该方法需提前将外源attB位点插入至染色体中，比较耗时；该方法很难用于遗传操作困难的菌株，因为此时将不能再使用高效的CRISPR/Cas9技术引入外源attB位点，等等。因此针对MSGE 方法的不足，有必要进一步开发新一代基因簇多拷贝扩增方法。

发明内容

为了克服MSGE方法的不足，避免一步实现多拷贝同时插入放线菌基因组时比较困难、成功率低的缺陷，我们设计了目标基因簇两轮迭代插入放线菌基因组的多拷贝整合方法。

因此，本发明的第一个目的在于提供一种用于整合多拷贝基因簇的即插即用型整合系统或称整合工具箱。

本发明的第二个目的在于提供一种在放线菌基因组整合多拷贝基因簇的方法。

为了达到上述目的，本发明采用如下技术方案：